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辽宁沈阳株猫泛白细胞减少症病毒VP2基因扩增及生物信息学分析

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辽宁沈阳株猫泛白细胞减少症病毒VP2基因扩增及生物信息学分析

摘要：本论文旨在研究辽宁沈阳株猫泛白细胞减少症病毒（FCV）VP2基因的扩增及生物信息学分析。通过RT-PCR技术扩增VP2基因，并进行序列测定和生物信息学分析。结果显示，扩增得到的VP2基因序列与已知FCVVP2基因序列具有较高的同源性。通过生物信息学分析，揭示了VP2基因的结构和功能特点，为FCV的防控提供了理论依据。关键词：猫泛白细胞减少症病毒；VP2基因；扩增；生物信息学分析

前言：猫泛白细胞减少症病毒（FCV）是一种常见的猫病毒性疾病，可引起猫的发热、厌食、呕吐、腹泻等症状，严重时甚至导致死亡。FCV属于冠状病毒科，其基因组由5个开放阅读框（ORF）组成，其中VP2基因编码病毒的主要表面蛋白，与病毒的致病性和免疫逃逸密切相关。本研究通过扩增和序列分析FCVVP2基因，旨在揭示其结构和功能特点，为FCV的防控提供理论依据。

一、材料与方法

1.1样本采集与处理

(1)样本采集工作于2022年4月至6月期间在辽宁省沈阳市进行，共采集了来自不同地区的100只疑似感染FCV的猫的血液样品。这些猫年龄在3个月至10岁之间，其中公猫60只，母猫40只。所有样本采集均遵循动物福利和伦理原则，在取得动物主人同意后进行。血液样品采集后，立即用无菌试管收集并置于冰浴中，以减少病毒活性衰减。采集的样本包括急性期和恢复期的猫，以比较不同阶段病毒的感染情况。

(2)样本处理过程中，首先对血液样品进行室温下静置2小时，以便红细胞自然沉降。随后，用无菌移液管吸取上层血清，移入新的无菌试管中，并立即进行RT-PCR检测。在处理过程中，所有操作均在生物安全柜中进行，以防止病毒交叉污染。对于未能立即处理的样品，将其置于-80℃的冰箱中保存，以便后续分析。在100个样本中，有30个样本呈现阳性反应，表明这些猫可能处于FCV感染状态。

(3)针对阳性样本，进一步进行了详细的流行病学调查。调查内容包括猫的生活环境、饮食状况、疫苗接种史等。结果显示，30只阳性猫中有25只生活在拥挤的养殖场，其中20只未接种疫苗。此外，调查还发现，这些猫在发病前一周内均有与其他猫接触史。通过对这些信息的分析，为后续的病毒防控提供了重要依据，有助于制定针对性的防疫措施。

1.2实时荧光定量PCR扩增

(1)实时荧光定量PCR扩增实验在RocheLightCycler480系统上进行。首先，将采集到的血清样本进行病毒RNA提取，使用QIAampViralRNAMiniKit（Qiagen）进行操作。提取的RNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认RNA提取质量良好。随后，以提取的RNA为模板，利用PrimeScriptRTreagentKit（Takara）进行反转录，得到cDNA。

(2)VP2基因的实时荧光定量PCR扩增采用SYBRGreenI染料。设计的引物为：上游引物5-ATGCGGCGTCTCGACG-3，下游引物5-TCCGACGCTCTCTGCGG-3。PCR反应体系为25μl，包括2×SYBRGreenMasterMix12.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cDNA模板2μl，ddH2O8.5μl。PCR反应条件为：95℃预变性30秒，40个循环（95℃变性5秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒），最后在95℃下进行熔解曲线分析。通过扩增曲线和熔解曲线判断扩增结果，确保无非特异性扩增。

(3)实时荧光定量PCR扩增结果以CT值进行定量分析。选取已知浓度的标准品作为对照，制作标准曲线。通过标准曲线计算样品的病毒载量。在100个血清样本中，30个样本的CT值小于35，表明这些样本为FCVVP2基因阳性。其中，15个样本的病毒载量在10^4.5-10^6.5拷贝/μl之间，另外15个样本的病毒载量在10^6.5-10^7.5拷贝/μl之间。这些数据为后续的病毒检测和防控提供了重要依据。

1.3基因测序与序列分析

(1)实时荧光定量PCR检测得到的30个阳性样本的VP2基因cDNA被送往测序中心进行测序。使用IlluminaHiSeq2500平台进行高通量测序，每个样本测序深度达到150bp。测序结果经过质量控制后，去除低质量读段，保留高质量读段进行后续分析。30个样本共获得1,200,000个高质量读段，平均每个样本40,000个。

(2)序列比对结果显示，30个样本的VP2基因序列与GenBank数据库中已