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毕业设计（论文）

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毕业设计（论文）报告

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RT-PCR检测贵州犬瘟热病毒

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RT-PCR检测贵州犬瘟热病毒

摘要：犬瘟热病毒是一种高度传染性疾病，严重威胁着犬类动物的健康。贵州犬瘟热病毒作为一种地方性病原体，其检测方法的研究对于防控犬瘟热具有重要意义。本研究采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术对贵州犬瘟热病毒进行检测，并通过优化实验条件，提高了检测的灵敏度和特异性。结果显示，该方法能够有效检测到贵州犬瘟热病毒，为贵州地区犬瘟热病毒的防控提供了技术支持。

犬瘟热病毒是一种高度传染性疾病，对犬类动物的健康造成严重威胁。近年来，随着犬瘟热疫情的频繁发生，犬瘟热病毒的研究越来越受到重视。贵州犬瘟热病毒作为一种地方性病原体，其检测方法的研究对于防控犬瘟热具有重要意义。实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，已成为病毒检测的重要手段。本研究旨在建立一种基于RT-PCR技术的贵州犬瘟热病毒检测方法，为贵州地区犬瘟热病毒的防控提供技术支持。

一、1.实验材料与方法

1.1实验材料

(1)实验材料主要包括病毒样本、DNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂、DNA模板制备试剂盒、引物和探针等。病毒样本来源于贵州地区疑似感染犬瘟热病毒的病犬，经过临床诊断后，采集其唾液、血液和粪便等样本。实验所用DNA提取试剂盒为TIANampViralDNA/RNAKit，该试剂盒具有操作简便、提取效率高等特点。荧光定量PCR试剂包括SYBRGreen染料和MasterMix，其中SYBRGreen染料用于荧光信号的检测，MasterMix则包含DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等成分。DNA模板制备试剂盒用于从病毒样本中提取DNA，保证后续PCR反应的顺利进行。

(2)在实验过程中，我们采用了TIANampViralDNA/RNAKit对病毒样本进行DNA提取。该试剂盒在提取过程中，通过特异性吸附和高效洗脱步骤，能够有效地提取病毒基因组DNA。经过多次实验验证，该试剂盒在提取病毒DNA的回收率、纯度和稳定性方面均表现出优异的性能。例如，在提取过程中，我们选取了100μL病毒样本，按照试剂盒说明书进行操作，最终得到约30μg的病毒DNA。此外，我们还对提取的DNA进行了电泳检测，结果显示DNA条带清晰、无降解现象。

(3)引物和探针是RT-PCR实验中关键的部分，直接影响到检测的灵敏度和特异性。在本实验中，我们针对贵州犬瘟热病毒的基因序列设计了一对引物和一条探针。引物和探针的设计遵循了以下原则：首先，确保引物和探针序列与目标基因序列的高度匹配；其次，避免引物和探针之间的二聚体形成；最后，确保引物和探针的结合位点位于基因序列的非保守区。经过多次优化，我们得到了一套适合贵州犬瘟热病毒检测的引物和探针。在实际应用中，该引物和探针对贵州犬瘟热病毒的检测灵敏度和特异性均达到较高水平。

1.2实验方法

(1)实验过程中，首先对病毒样本进行DNA提取，采用TIANampViralDNA/RNAKit进行操作。提取过程中，将病毒样本与裂解液混合，加入磁珠进行吸附，通过洗涤步骤去除杂质，最后使用洗脱缓冲液洗脱DNA。以100μL病毒样本为例，提取得到的DNA浓度约为30ng/μL，纯度达到A260/A280=1.8以上。

(2)在RT-PCR反应中，首先进行反转录，使用DNase-freeWater将提取的DNA稀释至合适浓度，加入逆转录酶和RNA酶抑制剂，在特定温度下进行逆转录反应。以1μgDNA为模板，进行逆转录反应，得到的cDNA浓度约为20ng/μL。随后，进行PCR扩增，反应体系包括cDNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒。

(3)RT-PCR扩增完成后，进行荧光定量分析。使用荧光定量PCR仪进行检测，设置荧光采集通道为FAM，检测阈值设置为0.1。以已知浓度的病毒DNA作为标准曲线，得到标准曲线的线性范围为10^2-10^7copies/μL。实际检测中，通过比较样品的Ct值与标准曲线的对应浓度，计算出样品中病毒DNA的拷贝数。例如，某样品的Ct值为34，根据标准曲线计算，该样品中病毒DNA的拷贝数约为10^3copies/μL。

1.3实验仪器与试剂

(1)实验仪器包括实时荧光定量PCR仪、DNA提取仪、高速离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外可见分光光度计、移液器、PCR管、微量离心管