DB22T 2922-2018 鸡传染性支气管炎病毒检测 荧光RT-PCR法.docxVIP

ICS11.220B41

DB22

吉林省地方标准DB22/T2922—2018

鸡传染性支气管炎病毒检测荧光RT-PCR法

DetectionofchickeninfectiousbronchitisvirusReal-timePCRmethod

2018-11-12发布2018-12-30实施

吉林省市场监督管理厅发布

I

DB22/T2922—2018

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：呼延含蓉、程荣华、柴方红、张淑莹、王楠、于钦磊、高春生、吴丹、孙亮、马晓媛、卢松岩、付瑶、王建超、陆伟、何浩、傅国群。

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DB22/T2922—2018

鸡传染性支气管炎病毒检测荧光RT-PCR法

1范围

本标准规定了鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测方法的材料、操作步骤和结果判定。本标准适用于鸡传染性支气管炎的诊断、监测及流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3材料

3.1仪器设备

3.1.1干热灭菌箱。

3.1.2高压蒸汽灭菌器。160℃。

3.1.3冰箱，2℃~8℃,-20℃和-80℃三种。

3.1.4恒温水浴锅，控温范围为室温至100℃。

3.1.5可调移液器，最大量程为10μL，200μL，1000μL。

3.1.6高速冷冻离心机，12000r/min以上。

3.1.7荧光定量PCR扩增仪。

3.2器械与耗材

3.2.1医用棉签。

3.2.2医用剪刀，16cm。

3.2.3医用镊子，16cm。

3.2.41.5mL离心管，15mL离心管，50mL离心管。

3.2.5组织匀浆器或研钵。

3.2.6吸头，10μL，200μL，1000μL。

3.2.7荧光PCR管。3.3试剂

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。3.3.10.02mmol/LPBS，见附录A。

3.3.2RNA提取试剂盒。

3.3.3荧光RT-PCR反应液。

3.3.4灭菌双蒸水。

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3.3.5阳性对照，鸡传染性支气管炎病毒S1基因序列片段，见附录B。

3.4引物和探针

3.4.1引物和探针序列见表1。

表1引物和探针序列

名称

序列

上游引物F

5-ATCCTTTTATTAATAGTA-3

下游引物R

5-TAGTTTCTAGTCTAAAATTAC-3

探针P

5-CAAACACAAACAGCTCAGAGT-3

3.4.2引物和探针均用灭菌双蒸水稀释成10μmol/L，-20℃保存备用。

4操作步骤

4.1采样器具前处理

4.1.1组织匀浆器或研钵（3.2.5）、医用剪刀（3.2.2）、镊子（3.2.3）经160℃干热（3.1.1）灭菌2h。

4.1.21.5mL离心管（3.2.4）经121℃±2℃高压蒸汽（3.1.2）灭菌15min。

4.2样品的采集、贮运和保存

4.2.1棉拭子样品的采集

将医用棉签（3.2.1）深入喉头上腭及上腭裂来回刮3次～5次，使其蘸有咽喉分泌液，然后将咽喉拭子放入盛有1.0mLPBS（3.3.1）的离心管中，编号备用。

4.2.2组织样品的采集

采集鸡气管的下1/3段和肺脏，置于无菌离心管（15mL或50mL）。

4.2.3样品的贮运

样品采集后应置于加冰袋的保温箱中、密封，24h内送至实验室进行处理，超过24h应冷冻保存。

4.3样品的处理

4.3.1棉拭子的处理

将装有棉拭子的离心管反复震荡离心，3000r/min离心15min，取上清液待检。

4.3.2组织样品的处理

将组织样品按1:10比例加入PBS，用组织匀浆器或研钵研磨匀浆，3000r/mi