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ICS11.220B41
DB22
吉林省地方标准DB22/T2922—2018
鸡传染性支气管炎病毒检测荧光RT-PCR法
DetectionofchickeninfectiousbronchitisvirusReal-timePCRmethod
2018-11-12发布2018-12-30实施
吉林省市场监督管理厅发布
I
DB22/T2922—2018
前言
本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。
本标准起草单位:吉林省动物疫病预防控制中心。
本标准主要起草人:呼延含蓉、程荣华、柴方红、张淑莹、王楠、于钦磊、高春生、吴丹、孙亮、马晓媛、卢松岩、付瑶、王建超、陆伟、何浩、傅国群。
1
DB22/T2922—2018
鸡传染性支气管炎病毒检测荧光RT-PCR法
1范围
本标准规定了鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测方法的材料、操作步骤和结果判定。本标准适用于鸡传染性支气管炎的诊断、监测及流行病学调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3材料
3.1仪器设备
3.1.1干热灭菌箱。
3.1.2高压蒸汽灭菌器。160℃。
3.1.3冰箱,2℃~8℃,-20℃和-80℃三种。
3.1.4恒温水浴锅,控温范围为室温至100℃。
3.1.5可调移液器,最大量程为10μL,200μL,1000μL。
3.1.6高速冷冻离心机,12000r/min以上。
3.1.7荧光定量PCR扩增仪。
3.2器械与耗材
3.2.1医用棉签。
3.2.2医用剪刀,16cm。
3.2.3医用镊子,16cm。
3.2.41.5mL离心管,15mL离心管,50mL离心管。
3.2.5组织匀浆器或研钵。
3.2.6吸头,10μL,200μL,1000μL。
3.2.7荧光PCR管。3.3试剂
除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。3.3.10.02mmol/LPBS,见附录A。
3.3.2RNA提取试剂盒。
3.3.3荧光RT-PCR反应液。
3.3.4灭菌双蒸水。
2
DB22/T2922—2018
3.3.5阳性对照,鸡传染性支气管炎病毒S1基因序列片段,见附录B。
3.4引物和探针
3.4.1引物和探针序列见表1。
表1引物和探针序列
名称
序列
上游引物F
5-ATCCTTTTATTAATAGTA-3
下游引物R
5-TAGTTTCTAGTCTAAAATTAC-3
探针P
5-CAAACACAAACAGCTCAGAGT-3
3.4.2引物和探针均用灭菌双蒸水稀释成10μmol/L,-20℃保存备用。
4操作步骤
4.1采样器具前处理
4.1.1组织匀浆器或研钵(3.2.5)、医用剪刀(3.2.2)、镊子(3.2.3)经160℃干热(3.1.1)灭菌2h。
4.1.21.5mL离心管(3.2.4)经121℃±2℃高压蒸汽(3.1.2)灭菌15min。
4.2样品的采集、贮运和保存
4.2.1棉拭子样品的采集
将医用棉签(3.2.1)深入喉头上腭及上腭裂来回刮3次~5次,使其蘸有咽喉分泌液,然后将咽喉拭子放入盛有1.0mLPBS(3.3.1)的离心管中,编号备用。
4.2.2组织样品的采集
采集鸡气管的下1/3段和肺脏,置于无菌离心管(15mL或50mL)。
4.2.3样品的贮运
样品采集后应置于加冰袋的保温箱中、密封,24h内送至实验室进行处理,超过24h应冷冻保存。
4.3样品的处理
4.3.1棉拭子的处理
将装有棉拭子的离心管反复震荡离心,3000r/min离心15min,取上清液待检。
4.3.2组织样品的处理
将组织样品按1:10比例加入PBS,用组织匀浆器或研钵研磨匀浆,3000r/mi
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