应用PCR技术检测鸡产蛋下降综合征病毒.docx

毕业设计（论文）

PAGE

1-

毕业设计（论文）报告

题目：

应用PCR技术检测鸡产蛋下降综合征病毒

学号：

姓名：

学院：

专业：

指导教师：

起止日期：

应用PCR技术检测鸡产蛋下降综合征病毒

摘要：鸡产蛋下降综合征（EDS-76）是由鸡产蛋下降综合征病毒（EDSV）引起的一种高度传染性、急性病毒性疾病。本文旨在通过PCR技术检测鸡产蛋下降综合征病毒，分析其病毒基因型及其在鸡群中的流行情况。首先，本研究建立了基于EDSV基因序列的PCR检测方法，并对鸡群样本进行了病毒检测。结果表明，该方法具有高灵敏度和特异性。其次，对分离得到的EDSV进行基因测序，分析了其基因型。最后，对检测到的EDSV进行流行病学调查，探讨了病毒在鸡群中的传播规律。本研究为EDS-76的防控提供了科学依据。关键词：鸡产蛋下降综合征；PCR检测；基因型；流行病学调查。

前言：鸡产蛋下降综合征是一种严重威胁养鸡业的传染病，主要表现为产蛋率下降、蛋品质降低等症状。近年来，随着养殖规模的扩大和鸡群的流动性增加，EDS-76的流行范围不断扩大，给养殖业造成了巨大的经济损失。因此，对EDS-76的早期诊断和有效防控具有重要意义。PCR技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，已成为病毒检测的重要手段。本研究旨在建立基于PCR技术的鸡产蛋下降综合征病毒检测方法，为EDS-76的防控提供技术支持。

一、材料与方法

1.1病毒样本采集与处理

(1)病毒样本的采集是进行鸡产蛋下降综合征病毒（EDSV）检测的第一步，直接关系到后续实验结果的准确性。本研究采用无菌操作技术，从疑似感染鸡群中采集病鸡的粪便、泄殖腔拭子以及组织样本。采集时，确保样本容器无菌，避免交叉污染。粪便样本需采集新鲜，并迅速置于含有抗生素的生理盐水中保存，以防止细菌污染。泄殖腔拭子样本则直接插入鸡的泄殖腔内旋转360度，停留约30秒，随后将拭子放入无菌试管中。组织样本则取自肝脏、脾脏等病变部位，用无菌剪刀剪碎后加入适量生理盐水，制成悬液。

(2)采集到的病毒样本在实验室中需进行初步处理。粪便和泄殖腔拭子样本首先通过低速离心去除杂质，取上清液作为PCR检测的模板。组织样本在剪碎后加入适量裂解液，通过高速离心分离细胞碎片和核酸，取上清液作为PCR模板。所有处理过程均在超净台中完成，以防止污染。在处理过程中，严格控制操作环境，确保样本的无菌状态。

(3)处理后的病毒样本需进行质量控制，以确保PCR检测的准确性。对每个样本进行电泳检测，观察核酸的完整性和浓度。对于电泳结果显示核酸降解或浓度过低的样本，需重新采集或处理。同时，设立阴性对照和阳性对照，以验证PCR检测方法的特异性和灵敏度。阴性对照使用无菌生理盐水代替病毒样本，阳性对照则使用已知的EDSV阳性样本。通过以上步骤，确保病毒样本的采集和处理符合实验要求，为后续的PCR检测奠定基础。

1.2PCR检测方法的建立

(1)针对鸡产蛋下降综合征病毒（EDSV）的PCR检测方法建立，本研究首先设计特异性引物，通过查阅已发表的EDSV基因序列，结合生物信息学分析，确保引物能够高效扩增目标基因。设计完成后，通过合成引物并进行体外扩增验证，确保引物具有良好的扩增性能。在优化PCR反应条件时，对退火温度、循环次数和扩增体系等参数进行逐一调整，以达到最佳扩增效果。

(2)PCR反应体系包括DNA模板、特异性引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液等。为确保PCR反应的稳定性和准确性，本研究采用了热启动技术，以避免非特异性扩增。在PCR扩增过程中，使用荧光定量PCR技术，实时监测扩增曲线，以便及时调整反应条件。通过优化后的PCR反应，确保扩增的特异性强，无交叉污染。

(3)为了验证PCR检测方法的准确性和可靠性，本研究进行了标准曲线的制作、灵敏度测试和特异性测试。标准曲线的制作通过将已知浓度的EDSVDNA模板进行梯度稀释，得到扩增曲线，从而确定PCR检测的线性范围和灵敏度。灵敏度测试通过将已知浓度的EDSVDNA模板与不同浓度的其他病毒DNA模板进行混合，检测交叉污染情况，以确保PCR检测的特异性。最终，建立的PCR检测方法具有较高的灵敏度、特异性和重复性，为鸡产蛋下降综合征病毒的检测提供了可靠的技术手段。

1.3基因测序与基因型分析

(1)在完成鸡产蛋下降综合征病毒（EDSV）的PCR检测后，对分离得到的病毒进行基因测序，以分析其基因型。本研究采用Illumina测序平台对EDSV的基因组进行测序，获得了高覆盖度的测序数据。通过对测序结果的拼接和组装，成功获得了EDSV的全长基因组序列。通过对该序列与已知的EDSV基因序列进行比对分析，确定了本研究分离得到的EDSV属于基因型A，与已报道的基因型A序列同