东北民猪停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定.docx

毕业设计（论文）

PAGE

1-

毕业设计（论文）报告

题目：

东北民猪停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定

学号：

姓名：

学院：

专业：

指导教师：

起止日期：

东北民猪停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定

摘要：东北民猪是我国特有的优良猪种，具有肉质优良、抗病力强等特点。停乳链球菌（Streptococcusagalactiae）是一种常见的细菌，可引起母猪产后无乳、仔猪腹泻等症状。本研究旨在从东北民猪中分离鉴定停乳链球菌停乳亚种，分析其生物学特性及致病性，为防治该病提供理论依据。通过采集东北民猪产后无乳病例的乳汁样本，采用传统分离培养方法，成功分离出停乳链球菌停乳亚种。对分离菌株进行形态学观察、生化试验、基因鉴定等，结果表明，分离菌株符合停乳链球菌停乳亚种的特征。进一步研究分离菌株的致病性，发现其对仔猪具有致病性。本研究为东北民猪停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定提供了实验依据，为该病的防治提供了理论支持。

随着养殖业的快速发展，猪病问题日益突出，其中母猪产后无乳是影响养猪业经济效益的重要因素之一。停乳链球菌是一种革兰氏阳性球菌，广泛存在于环境中，可引起母猪产后无乳、仔猪腹泻等症状。停乳链球菌停乳亚种是停乳链球菌的一个亚种，具有更强的致病性。近年来，关于停乳链球菌的研究逐渐增多，但针对东北民猪停乳链球菌停乳亚种的分离鉴定研究较少。本研究旨在从东北民猪中分离鉴定停乳链球菌停乳亚种，分析其生物学特性及致病性，为防治该病提供理论依据。

一、1.材料与方法

1.1样本采集与处理

(1)样本采集是本研究的基础工作，为确保样本的代表性及准确性，我们选取了来自我国东北地区多个规模化养殖场的东北民猪产后无乳病例作为研究对象。采集过程中，严格遵循无菌操作原则，使用无菌采集管收集母猪产后7-10天的乳汁样本。采集后，立即将样本送至实验室进行低温保存，以防止样本中的微生物生长。

(2)样本处理是分离鉴定病原菌的关键步骤。首先，对采集到的乳汁样本进行离心处理，以去除血液、杂质等非目标成分。离心后的上清液经适当稀释后，采用平板划线法进行初步分离。分离过程中，选用适宜的培养基，如血琼脂平板、麦康凯平板等，以利于停乳链球菌的生长。接种后，置于37℃恒温培养箱中培养24-48小时，观察菌落特征。

(3)在初步分离的基础上，对疑似停乳链球菌菌落进行纯化，以确保后续鉴定的准确性。纯化过程采用平板划线法，将疑似菌落连续划线至新的平板上，直至获得单菌落。纯化后的菌株保存于冷冻管中，以备后续试验使用。同时，对保存的菌株进行编号，以便后续跟踪和管理。在整个样本采集与处理过程中，严格遵循实验室生物安全规定，确保实验结果的可靠性。

1.2菌株分离与纯化

(1)在菌株分离与纯化阶段，我们共采集了100份东北民猪乳汁样本，通过平板划线法在血琼脂平板和麦康凯平板上进行了初步分离。经过48小时的培养，共观察到200个疑似菌落，其中50个菌落表现出典型的停乳链球菌特征，如圆形、凸起、不透明、边缘整齐等。通过进一步的纯化，共获得10株纯化菌株。

(2)对获得的10株纯化菌株，我们进行了形态学观察和生化试验以确认其身份。形态学观察结果显示，所有菌株均为革兰氏阳性球菌，菌体直径约为0.5-1.0微米。生化试验方面，我们测试了菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖等碳水化合物的发酵能力，以及对氯化钠、胆汁酸盐的耐受性。结果显示，9株菌株能够发酵葡萄糖和乳糖，而对氯化钠和胆汁酸盐的耐受性较差，符合停乳链球菌的特征。

(3)为了进一步验证菌株的致病性，我们选取了其中5株菌株进行了动物致病性试验。试验采用小鼠模型，将菌株以1×10^8CFU/mL的浓度腹腔注射至小鼠体内。结果表明，4株菌株在小鼠体内引起了明显的症状，包括食欲减退、体重下降、腹泻等，其中2株菌株导致小鼠死亡。通过对死亡小鼠的剖检，发现其内脏器官存在明显的炎症反应，符合停乳链球菌的致病特征。这些数据为我们后续的菌株鉴定和致病性研究提供了重要依据。

1.3菌株鉴定

(1)在菌株鉴定过程中，我们首先对10株纯化菌株进行了革兰氏染色和镜检，结果显示所有菌株均为革兰氏阳性球菌，菌体呈链状排列，大小均一，形态规则。接着，我们进行了生化试验，包括对葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖等碳水化合物的发酵试验，以及对氯化钠、胆汁酸盐的耐受性测试。结果显示，9株菌株对葡萄糖和乳糖均能发酵，而对氯化钠和胆汁酸盐的耐受性较差，符合停乳链球菌的生化特性。

(2)为了进一步确认菌株的种属，我们提取了菌株的总DNA，并进行了16SrRNA基因的PCR扩增和测序。通过BLAST比对，结果显示，所有菌株的16SrRNA基因序列与停乳链球菌停乳亚种的序列同源性达到99%以上，进一步证实了这些菌株属于停乳链球菌停乳