重组DNA导入受体细胞.ppt

关于重组DNA导入受体细胞第1页，共25页，星期日，2025年，2月5日转化转染转导接合转移1.重组体导入细菌细胞（1）大肠杆菌重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化（transformation)。转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。化学诱导感受态法电转化感受态细胞（competencecell）是指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。★★第2页，共25页，星期日，2025年，2月5日I.化学诱导感受态法原理：E.coli细胞处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜形成液晶结构，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，液晶结构被扰动而使细胞膜出现间隙，促使DNA复合物进入细胞，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。第3页，共25页，星期日，2025年，2月5日Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到106～108转化子/?gDNA。化学法简单、快速、稳定、重复性好，感受态细菌可以在-70℃保存，但转化DNA大小有限制，不同物种需要不同的诱导方法。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。第4页，共25页，星期日，2025年，2月5日培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬感受态细胞制备制备感受态菌必须使用对数生长期的菌，且必须在冰冷的条件下制备。CaCl2处理充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在-70℃以下，使用感受态菌时必须迅速融化，融化后一般不能再次冻存使用第5页，共25页，星期日，2025年，2月5日10ng质粒DNA100?L感受态菌冰上混合，静置10分钟42oC1分钟冰浴2min，加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100?L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA转化过程第6页，共25页，星期日，2025年，2月5日II.电转化可以转化大分子DNA（50Kb)，胞壁较厚的物种需要制备原生质体后电转化电穿孔转化法最早用于将DNA导入真核细胞，1988年，Dower等人成功地应用该法进行了大肠杆菌的转化。原理:利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electroporation),形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每微克DNA可以得到109～1010转化子。电压增高或电脉冲时间延长时，转化效率将会提高，但受体细胞存活率会降低。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50%～70%细菌死亡时，转化效率达到最高。★第7页，共25页，星期日，2025年，2月5日LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，4℃离心集菌冰冷的水重悬菌体4℃离心集菌冰冷的水重悬菌体4℃离心收集菌体少量冰冷的水重悬细胞分装成50?L电转仪调为2.5kV,25?F脉冲控制器200-400?0.5?g质粒DNA混合、冰浴加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟涂布转化细胞制备：电转化：第8页，共25页，星期日，2025年，2月5日用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备要容易，当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10%甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×1010个／ml，分装，在干冰上速冻后置于-70℃贮存。每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上一般电穿孔转化须在低温下（0～4℃）进行，转化效率要比在室温下操作提高约100倍。由于细菌细胞相对较小，因此与DNA导入真核细胞时相比，大肠杆菌的电转化要求有更高的场强，而反应体积则相对要小，以20～40μl为宜。第9页，共25页，星期日，2025年，2月5日第10页，共25页，星期日，2025年，2月5日第11页，共25页，星期日，2025年，2月5日（2）