01关于蓝舌病毒增值.docx

以下是基于BHK-21细胞（仓鼠肾细胞）培养扩增蓝舌病毒（Bluetonguevirus,BTV）的详细实验方法步骤，并附上相关英文参考文献。

一、实验方法步骤

细胞准备

1.*细胞复苏

-从液氮中取出冻存的BHK-21细胞，迅速放入37℃水浴中解冻。

-将细胞悬液转移至含4-6mL完全培养基（90%MEM+10%FBS+1%双抗）的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清。

-用新鲜完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶中，置于37℃、5%CO?培养箱中培养。

2.**细胞传代

-当细胞密度达到80%-90%时，进行传代。

-弃去旧培养基，用PBS洗涤细胞一次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1-2分钟。

-加入含10%FBS的培养基终止消化，轻轻吹打细胞，按1:2至1:5的比例分瓶传代。

病毒接种

1.**病毒准备**：

-将蓝舌病毒（BTV）接种物解冻，轻轻混匀。

-用完全培养基稀释病毒至所需感染复数（MOI，通常为0.01-0.1）。

2.**接种细胞**：

-弃去BHK-21细胞的旧培养基，用PBS洗涤一次。

-加入稀释后的病毒悬液，轻轻摇晃培养瓶使病毒均匀分布。

-置于37℃、5%CO?培养箱中吸附1-2小时。

-吸附结束后，加入新鲜完全培养基，继续培养。

病毒扩增**

1.**培养观察**：

-每天观察细胞病变效应（CPE），通常在接种后24-48小时可见细胞变圆、脱落等病变。

-当CPE达到70%-80%时，收集细胞培养上清液。

2.**病毒收获**：

-将细胞培养上清液转移至离心管中，1000rpm离心10分钟，去除细胞碎片。

-收集上清液，分装后保存于-80℃备用。

病毒效价测定**

1.**空斑试验**：

-将BHK-21细胞接种至6孔板，待细胞长至单层。

-用10倍系列稀释的病毒上清感染细胞，吸附1-2小时后覆盖含1%琼脂糖的培养基。

-培养3-5天后，用中性红染色，计数空斑数，计算病毒效价（PFU/mL）。

2.**TCID50测定**：

-将病毒上清进行10倍系列稀释，接种至96孔板中的BHK-21细胞。

-培养5-7天后，观察CPE，用Reed-Muench法计算TCID50。

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英文参考文献**

1.**Mertens,P.P.,etal.(2005).**Bluetonguevirusreplication,molecularandstructuralbiology.*VeterinaryResearch*,36(2),171-187.

-该文献详细描述了蓝舌病毒的复制机制及其在BHK-21细胞中的增殖特性。

2.**MacLachlan,N.J.,Mayo,C.E.(2013).**Bluetonguevirus:virology,pathogenesis,andimmunity.*VeterinaryMicrobiology*,165(3-4),205-216.

-该文献综述了蓝舌病毒的生物学特性及其在哺乳动物细胞中的增殖机制。

3.**Verwoerd,D.W.,Erasmus,B.J.(2004).**Bluetongue.*InfectiousDiseasesofLivestock*,2,939-958.

-该文献提供了蓝舌病毒在细胞培养中的详细实验方法，包括BHK-21细胞的使用。

###**注意事项**

-实验操作需在生物安全二级（BSL-2）实验室进行。

-病毒接种和收获时需佩戴防护装备，避免气溶胶产生。

-细胞培养基和试剂需无菌处理，避免污染。

通过上述方法，可以高效扩增蓝舌病毒，并用于后续研究或疫苗开发。如需进一步优化实验条件，可参考相关文献。