疫组织化学染色sp技术.pptVIP

武汉大学病理教研室01免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内的抗原（或抗体）的分布进行定位、定性、定量检测，经过组织化学呈色反应在组织原位显示抗原（或抗体），如各种蛋白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门新技术。02免疫组织化学技术的定义武汉大学病理教研室IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞周期和信号转导的研究等。免疫组织化学的应用武汉大学病理教研室实验名称链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法(Streptavidin-PeroxidaseConjugatedMethod,简称S-P法)检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达01武汉大学病理教研室05生物素化二抗04生物素02过氧化物酶03链酶亲和素06特异性一抗07待测抗原S-P法原理示意图免疫组织化学基本实验流程武汉大学病理教研室正常血清封闭显色复染封片01组织、细胞标本滴加二抗抗原修复滴加三抗阻断内源性过氧化物酶滴加特异性一抗0203武汉大学病理教研室具体步骤如下：1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；2．所有组织均采用微波修复抗原；3．室温冷却后，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒孵育10min；5．0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育10min；武汉大学病理教研室7．甩去多余血清，分别滴加２种抗体，4℃湿盒孵育过夜，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；8．滴加生物素标记的二抗（试剂C），37℃湿盒孵育15min，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；9．滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂D），37℃湿盒孵育15min，甩去多余液体；10．每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液，光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来水充分冲洗，苏木素复染；11．常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；12．阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS取代第一抗体，其余步骤相同。武汉大学病理教研室01内源性过氧化物酶的灭活血清封闭冲洗抗体选择及一抗孵育时间检测及显色系统复染02实验流程中的注意事项武汉大学病理教研室染色前处理

取材、脱水、浸蜡组织及时固定固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林4%多聚甲醛常规下固定8-24小时取材厚度：2mm武汉大学病理教研室01染色前处理02预防脱片03常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine）04注意：1）应严格控制使用次数05玻片洁净度06武汉大学病理教研室染色前处理

包埋与切片包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62℃切片：厚度3-4μm烤片：温度60℃，时间1小时；或60℃2小时（迈新）；或60℃过夜武汉大学病理教研室染色前处理

切片保存切片不宜长时间在常温下保存染色前处理

脱腊原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE脱蜡分开武汉大学病理教研室抗原修复实验操作中的注意事项02武汉大学病理教研室01实验操作中的应用抗原修复武汉大学病理教研室影响染色结果的最关键因素抗原修复方法分类1）酶消化法2）加热法（高压法?水煮法?微波法）抗原修复液的选择1）柠檬酸盐缓冲液（）2）Tris（PH7-8）3）EDTA（PH8.0）武汉大学病理教研室内源性过氧化物酶的灭活存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、单核细胞、肝细胞及肾细胞消除方法：3%H2O2浸泡10分钟武汉大学病理教研室01目的：减少非特异性着色时间：一般在加载一抗之前使用02血清封闭武汉大学病理教研室01冲洗02一般采用PBS（）