荧光定量PCR检测项目.ppt

******血清型9种，但无特殊的临床意义。基因型：研究者[4]进一步分析了18株不同血清型HBV全基因序列,建立了以HBV全基因序列核苷酸异源性≥8%为不同基因型的分型标准,并将这18株HBV划分为A,B,C,D4种基因型。依据这个分型标准,Norder等[5]1994年发现基因型E和F;Stuyver等[6]2000年发现基因型G;Arauz2Ruiz等[7]2002年发现基因型H;至今为止已发现A～H8种基因型。**荧光定量PCR检测项目HBV-DNA定量乙肝基因分型乙肝拉米夫定耐药HCV-RNA定量病毒性脑炎实时荧光定量PCR方法------TaqMan法

方法：TaqMan法TaqMan---水解型杂交探针与目标序列互补5′端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针5’013’025’035’043’055’06ForwardPrimer07ReversePrimer08TaqMan?Probe09R10Q11Taqman实时PCR的反应过程5’013’025’035’043’055’06ForwardPrimer07ReversePrimer08R09Q10Displacement5’3’5’5’3’5’QRHydrolysisPolymerizationCompleted5’3’5’5’3’5’RQ每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法实时荧光定量PCR原理实时原理常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理定量原理如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析2014介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值2015扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)valueCt值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nX0：初始模板量n：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量Ex：扩增效率定量原理定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量标准曲线模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就