DB22T 3089-2019 羊传染性脓疱病毒检测 荧光PCR探针法.docxVIP

ICS11.220B41

DB22

吉林省地方标准DB22/T3089—2019

羊传染性脓疱病毒检测荧光PCR探针法

TaqManprobe-basedreal-timePCRassayfordetectionoforfvirus

2019-12-25发布2020-02-01实施

吉林省市场监督管理厅发布

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DB22/3089—2019

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。

本标准主要起草人：邵洪泽、王楠、王龙涛、王开、程荣华、柴方红、于钦磊、董航、葛永明、呼延含蓉、任锐、王欣宇。

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DB22/T3089—2019

羊传染性脓疱病毒检测荧光PCR探针法

1范围

本标准规定了羊传染性脓疱病毒（ORFV）ORF059基因荧光PCR检测方法的技术要求。本标准适用于羊传染性脓疱病毒基因的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫NY/T3235羊传染性脓疱诊断技术

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ORFV：羊传染性脓疱病毒（Orfvirus）

ORF：开放阅读框（OpenReadingFrame）

DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）Ct：循环阈值（Cyclethreshold）

4原理

根据羊传染性脓疱病毒（ORFV）ORF059基因序列设计引物和探针，探针在5’端标记FAM荧光素作为报告荧光基团，3’端分别标记TAMRA作为淬灭荧光基团。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。

5试验条件

5.1生物安全要求

所有培养物和废弃物的处置应符合GB19489的规定。5.2防污染措施

防止污染措施应符合GB/T27401的规定。

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DB22/T3089—2019

6试剂和材料

6.1试剂

6.1.1病毒DNA提取试剂盒。

6.1.2TapPathMasterMix。

6.1.3阳性对照：灭活的羊传染性脓疱病毒细胞培养物。

6.1.4阴性对照：不含羊传染性脓疱病毒细胞培养液。

6.1.5空白对照：ddH2O。6.2耗材

6.2.1吸头，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL。

6.2.2离心管，1.5mL。

6.2.3荧光PCR反应管，根据荧光PCR仪要求选择单管、八连排管或96孔荧光反应板。

6.3引物和探针

根据羊传染性脓疱病毒（ORFV）ORF059基因序列设计合成一对特异性引物和探针。上游引物5-TTGCACATGTCCGTGAAGAAGT-3。

下游引物5-AGGCGGTGGAATGGAAAGAC-3。

TaqMan探针（FAM）5-CGGGTAGTCTTTGGAGTC-3（TAMRA）。均配制成20μmol/L，-20℃避光保存，6个月内使用。

7仪器

7.1冰箱，-20±2℃。

7.2低温高速离心机，不低于12000r/min。

7.3可调微量移液器，200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL。7.4荧光PCR仪。

8样品

样品的采集和处理按NY/T3235规定进行。

9操作步骤

9.1模板的制备

采用病毒DNA提取试剂盒（6.1.1）提取（6.2.1、6.2.2、7.2、7.3）待检样品的核酸作为模板。阳性对照（6.1.3）、阴性对照（6.1.4）均按照待检样品提取方法进行操作。

9.2反应体系

用可调微量移液器（7.3）按表1中各组分依次加入荧光PCR反应管（6.2.3）后瞬