DB22T 3087-2019 猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株鉴别qPCR法　.docxVIP

ICS11.220B41

DB22

吉林省地方标准DB22/T3087—2019

猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株鉴别qPCR法

IdentificationofclassicalandvariantstrainsofporcineepidemicdiarrheavirusReal-timePCRmethod

2019-12-25发布2020-02-01实施

吉林省市场监督管理厅发布

I

DB22/T3087—2019

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林农业大学。

本标准主要起草人：张双、王开、郭衍冰、裴志花、黄海龙、朱俊辉、李响、胡桂学。

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DB22/T3087—2019

猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株鉴别qPCR方法

1范围

本标准规定了猪流行性腹泻病毒经典与变异毒株qPCR法技术的要求。本标准适用于猪流行性腹泻病毒经典毒株与变异毒株的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

GB/T36871猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒多重RT-PCR检测方法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

qPCR:实时荧光定量PCR(Real-timepolymerasechainreaction)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)

cDNA:互补脱氧核糖核酸(complementarydeoxyribonucleicacid)Rnase：核糖核酸酶(ribonuclease)

Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4原理

在普通聚合酶链反应的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

5试验条件

5.1生物安全措施

所有培养物和废弃物的处置应符合GB19489的规定。

5.2防污染措施

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DB22/T3087—2019

防止污染措施应符合GB/T27401的规定。

6试剂和材料

6.1试剂

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。6.1.1RNA提取试剂盒。

6.1.2反转录试剂盒。

6.1.3Rnasefreewater。

6.1.4ROXReferenceDyeⅡ。

6.1.5qPCRProbeMasterMix。

6.1.6阳性对照，以猪流行性腹泻病毒经典毒株CV777（GenBank：AF353555.1）和变异毒株HB-2012-1（GenBank：JX435302.1）的cDNA或含目的片段的阳性质粒。

6.1.7阴性对照，Rnasefreewater。6.2耗材

6.2.1无RNase离心管，0.2mL，1.5mL。

6.2.2无RNase吸头，10μL。

6.2.3吸头，10μL，200μL，1000μL。

6.2.4qPCR反应管，根据qPCR仪选配。

6.3引物和探针

表1qPCR的引物序列和浓度

引物和探针名称

序列

5’―3’

浓度pmol/μL

扩增片段大小bp

上游引物F

AYTTTAGGCGGTTCTTTTC

20

135

下游引物R

ARATACCATGAACGCCACT

20

探针C

HEX-GCAGTTGTYGYACTGGGCGGTT-TAMRA

10

探针V

FAM-GCCGTCGTYGYTTTGGGTGGTT-TAMRA

10

7仪器

7.1高速冷冻离心机，12000r/min以上。

7.2可调移液器，最大量程为10μL，200μL，