细胞电生理研究进展.ppt

(二)膜片钳电极的制备标本制备根据研究目的的不同，可采用不同的细胞组织，如心肌细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞等，现在几乎可对各种细胞进行膜片钳的研究。对所采用的细胞，必须满足实验要求，一般多采用酶解分离法，也可采用细胞培养法；另外，由于与分子生物学技术的结合，现在也运用分子克隆技术表达不同的离子通道，如利用非洲爪蟾卵母细胞表达外源性基因等。电极制备合格的膜片微电极是成功封接细胞膜的基本条件。要成功的封接细胞膜需要两方面的因素保证，一是设法造成干净的细胞膜表面，二是制成合格的电极。首先要选择适当的玻璃毛细管，其材料可使用软质玻璃（苏打玻璃、电石玻璃）或硬质玻璃（硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻璃）。软玻璃电极常用于作全细胞记录，硬质玻璃因导电率低、噪声小而常用于离子单通道记录。1电极玻璃2.电极在实验前要灌注电极液，由于电极尖端较细，因此在充灌前，电极内液要用0.2μm的滤膜进行过滤。一般电极充灌可分灌尖(tipfilling)和后充(backfilling)两步。灌尖时将电极尖端浸入内液中5s即可，由于毛细作用溶液会进入电极最尖端处，然后从电极后端用细小的聚丙烯注射管插至尖端附近将溶液充至1/4长度，用手指轻轻弹除尖端残留的气泡即可。灌注后的电极电阻一般为2～5MΩ，而全细胞记录则最好在2～3MΩ。进行实验，记录和分析数据准备工作就绪后即可进行实验操作，数据记录和分析膜片钳实验技术的新发展??传统膜片钳技术主要优缺点总结??????????????优????点缺????点A高信息量:能改变细胞膜电位,单细胞记录A需要受过良好训练的电生理学专家B高灵敏性:能记录到pA级电流变化和单通道开关状态B通量很低,一天的实验数据量不超过10C灵活性好:可以控制改变细胞膜内外的溶液成分C劳动力投入密集,试验操作过程复杂D应用范围广:可以分析检测所有的离子通道类型D不适合药物粗筛/二次筛选E相对于荧光标记和放射性标记等手段具有更高权威性和精确性E技术自动化非常困难,且不能进行平行检测膜片钳实验技术的新发展目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventionalpatchclamptechnique）发展到全自动膜片钳技术（Automatedpatchclamptechnique）。传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞），对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！膜片钳实验技术的新发展1.Flip-Tip翻转技术：

????????将一定密度的细胞悬液灌注在玻璃电极中，下降到电极尖端的单个细胞通过在电极外施加负压可以与玻璃电极尖端形成稳定的高阻封接，自动判断封接形成是否良好并自动破膜形成全细胞模式。随后,药物化合物等可以被自动应用到管内进行全细胞模式实验。这种方式形成的膜片钳完全排除显微镜和显微操作,从而革命性的实现膜片钳技术的全自动化。它的显著特点是仍然采用玻璃毛坯作为电极。SealChip技术：

璃电极，而是采用SealChip平面电极芯片，一定密度的细胞悬液灌注在芯片上面，随机下降到芯片上约1-2μm的孔上并在自动负压的吸引下形成高阻封接，打破孔下面的细胞膜形成全细胞记录模式。PopulationPatchClamp（PPC）技术：

p技术一样，完全摒弃了玻璃电极，而是采用PatchPlate平面电极芯片。该芯片含有多个小室，每个小室中含有很多1-2μm的封接孔。在记录时，每个小室中封接成功的细胞数目较多，获得的记录是这些细胞通道电流的平均值。总而言之,全自动膜片钳技术具有如下的优点:效率高,是传统膜片钳效率的20～300倍;不需要专业电生理人员,简单易用,所有的操作可以在电脑软件控制的界面下完成,无须显微防震系统;大部分仪器的封接质量在1GΩ以上;部分仪器同时适用于研究配体门控通道和电压门控通道;主要应用于药物药理和毒理测试;在药物微量加样设计方面表现优秀;仪器主要工作方式为全细胞膜片钳方式。缺点:仪器仅适用于悬浮细胞实验。无疑地,随着基因组测序的完成和蛋白质组学的兴起,离子通道在未来的细胞与药物方面研究将会变得越来越重要。与此同时,作为离子通道研究的最佳伴侣-全自动膜片钳,由于其独特的优点也必定在这一领域大展身手。3离子通道3.1重要的生理功能细胞生物电现象的基础参与维持细胞正常形态细胞兴奋-收缩偶联和兴奋