病毒的纯化与保存.ppt

病毒蛋白的分离

SDSPAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳Poly-AcrylamideGelElectrophoresis以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。第29页，共66页，星期日，2025年，2月5日PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法：化学聚合法。化学聚合以过硫酸铵（APS）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。第30页，共66页，星期日，2025年，2月5日连续与不连续PAGEPAGE按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。第31页，共66页，星期日，2025年，2月5日不连续PAGE不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳，它由浓缩胶和分离胶两部分所组成。由于浓缩胶的堆积（浓缩）作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度的凝胶上进行分离。样品颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较连续电泳系统佳。第32页，共66页，星期日，2025年，2月5日SDSSDS：十二烷基磺酸钠(重点)SDS是阴离子去垢剂，使蛋白质变性解聚，并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异，使各种蛋白质的电荷／质量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。第33页，共66页，星期日，2025年，2月5日SDS也称变性PAGE通常采用不连续垂直型系统浓缩胶、分离胶第34页，共66页，星期日，2025年，2月5日浓缩胶分离胶第35页，共66页，星期日，2025年，2月5日第36页，共66页，星期日，2025年，2月5日第37页，共66页，星期日，2025年，2月5日首次应用SDS的论文(了解)LaemmliUK(1970).CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature227:680-685.第38页，共66页，星期日，2025年，2月5日SDS实验步骤(熟悉)

1、清洗、烘干、组装电泳器材第39页，共66页，星期日，2025年，2月5日SDS实验步骤

2、1%琼脂封底第40页，共66页，星期日，2025年，2月5日SDS实验步骤

3、配制分离胶第41页，共66页，星期日，2025年，2月5日SDS实验步骤

4、灌注分离胶灌注完后，加水覆盖隔绝空气，同时可使界面平整一般20-30分钟凝固第42页，共66页，星期日，2025年，2月5日SDS实验步骤

5、配制、灌注浓缩胶，插上梳子第43页，共66页，星期日，2025年，2月5日SDS实验步骤

5、往电泳槽加电泳缓冲液，上样2×上样缓冲液(样品溶解液LoadingBuffer)：SDS,琉基乙醇，甘油，溴酚蓝，Tris-HCl缓冲溶液。蛋白样品与上样缓冲液1:1混合，沸水浴3分钟，离心，上样其中一个上样孔：蛋白分子量标准第44页，共66页，星期日，2025年，2月5日电泳缓冲液(电极缓冲液)包含SDS一般配制成10×或5×SDS实验步骤

6、连接电源，电泳开始第45页，共66页，星期日，2025年，2月5日SDS实验步骤

7、电泳结束，剥胶，染色，脱色染色液：考马斯亮蓝；银染法用硝酸银脱色液：甲醇/异丙醇+醋酸第46页，共66页，星期日，2025年，2月5日按下式计算相对迁移率：

每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分子量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。=蛋白样品距加样端迁移距离cm溴酚蓝区带中心距加样端距离cm相对迁移率8、蛋白相对分子质量测定(重点)第47页，共66页，星期日，2025年，2月5日第1页，共66页，星期日，2025年，2月5日病毒纯化目的(了解)为了了解病毒的结构、传染与免疫、遗传与变异等性质，常常需要高纯度的病毒第2页，共66页，星期日，