《分子生物学技术：基因克隆与原核表达》课件.pptVIP

分子生物学技术：基因克隆与原核表达本课件将带您深入了解分子生物学技术，特别是基因克隆与原核表达技术。

课程大纲与学习目标1课程大纲：基因克隆与原核表达的基本原理和技术2学习目标：掌握基因克隆与原核表达技术的原理，并能够独立完成相关实验3最终目标：能够应用基因克隆和原核表达技术，进行科研或生产实践

基因克隆的基本概念定义基因克隆是指将目标基因从基因组中分离出来，并将其插入到载体中，然后将其导入宿主细胞，使目标基因在宿主细胞中大量复制和表达的过程。目的基因克隆的目的在于获取大量纯化的目标基因，以便进行进一步的研究或应用，例如基因功能研究、蛋白质表达、基因治疗等。

分子克隆技术的发展历史11972年伯格等人首次将外源DNA片段插入到大肠杆菌质粒中，并成功地将该质粒导入大肠杆菌，标志着基因克隆技术的诞生。21973年科恩等人利用限制性内切酶和DNA连接酶，将外源基因插入到大肠杆菌质粒中，并成功地进行了基因克隆。31977年桑格等人发明了DNA测序技术，为基因克隆提供了强有力的工具。41980年代聚合酶链式反应(PCR)技术的出现，极大地促进了基因克隆技术的应用。51990年代基因组学、蛋白质组学等研究的兴起，对基因克隆技术提出了更高的要求，促进了高通量基因克隆技术的发展。

基因克隆的应用领域基础研究基因功能研究、基因表达调控研究、基因组学研究等生物技术基因治疗、生物医药、农业生物技术等工业生产蛋白质生产、酶制剂生产、生物农药生产等环境保护生物降解、污染物监测、生物修复等

基因克隆实验的安全注意事项操作时应戴好手套、口罩、护目镜等防护用具，避免接触有害物质。实验过程应严格遵守实验室安全操作规范，防止生物污染。操作易燃易爆物品时，应严格按照安全操作规范进行，避免火灾事故。实验结束后，应妥善处理废弃物，避免污染环境。

克隆实验的基本流程概述目的基因的获取通过PCR扩增、基因组DNA提取、RNA提取与反转录等方法获取目的基因。载体的选择与构建选择合适的载体，并根据需要进行载体构建，将目的基因插入到载体中。重组子的转化将构建好的重组载体导入宿主细胞，使重组载体在宿主细胞中复制和表达。重组子的筛选与鉴定利用蓝白斑筛选、抗性筛选、菌落PCR验证、测序验证等方法筛选和鉴定重组子。

目的基因的获取方法PCR扩增利用PCR技术将目的基因从基因组DNA或cDNA中扩增出来。基因组DNA提取从生物样品中提取基因组DNA，并进行目的基因片段的切割。RNA提取与反转录提取mRNA，然后通过逆转录酶将其反转录为cDNA，再进行目的基因片段的切割。

PCR扩增原理变性将双链DNA加热至94℃，使双链DNA解开成单链。退火将温度降至50-65℃，使引物与模板DNA单链的互补序列结合。延伸将温度升至72℃，由DNA聚合酶催化引物延伸，合成新的DNA链。

PCR引物设计要点1引物长度一般为18-30个碱基对，最佳长度为20-24个碱基对。2引物GC含量一般为40%-60%，避免过于偏高或偏低，以提高引物与模板DNA的结合效率。3引物之间应避免形成自身或互补的二级结构，以免影响PCR反应。4引物应选择在目的基因的非编码区或内含子区域，避免影响目的基因的表达。

PCR反应体系组成模板DNA含有目的基因的DNA片段引物与目的基因两侧序列互补的寡核苷酸片段dNTPsDNA合成的原料DNA聚合酶催化DNA链的合成缓冲液维持反应体系的pH值和离子强度Mg2+DNA聚合酶的辅助因子

PCR优化策略退火温度优化通过梯度PCR实验，确定最佳的退火温度，以提高引物与模板DNA的结合效率。Mg2+浓度优化Mg2+浓度过低会影响DNA聚合酶的活性，过高会抑制PCR反应，需要找到最佳浓度。循环次数优化循环次数过少会导致产物量不足，过高会导致非特异性扩增，需要找到最佳循环次数。引物浓度优化引物浓度过低会导致产物量不足，过高会导致非特异性扩增，需要找到最佳浓度。

基因组DNA提取方法样品准备选择合适的生物样品，例如血液、组织、细胞等，并进行预处理。细胞裂解使用裂解液破坏细胞膜和核膜，释放出DNA。蛋白质去除利用蛋白酶消化蛋白质，去除杂质蛋白质。DNA沉淀使用乙醇或异丙醇沉淀DNA，并将DNA沉淀物收集。DNA洗涤用洗涤液去除残留的杂质，提高DNA纯度。DNA溶解将DNA溶解于缓冲液中，制备成DNA溶液。

RNA提取与反转录1RNA提取使用RNA提取试剂盒或其他方法从生物样品中提取RNA。2RNA纯化对提取的RNA进行纯化，去除DNA、蛋白质等杂质。3反转录利用逆转录酶将RNA反转录为cDNA。

载体的选择原则1载体应具有复制起点(ori)，能够在宿主细胞中复制。2载体应含有合适的筛选标记，方便筛选含有载体的宿主细胞。3载体应具有多个限制性内切酶切割位点，方便插入外源基因。4载体应与宿主细胞相匹配