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抗除草剂Bar基因的优化及PAT蛋白的表达-最新年精选文档--第1页
抗除草剂Bar基因的优化及PAT蛋白的表达
DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2015.10.058
Bar基因作为筛选标记基因，具有快速、简便、高效、转化
细胞产生的假阳性个体少等优(Zea
点，被广泛应用于转基因玉米
maysL.)、大豆(GlycinemaX)、油菜(Brassicacampestris
L.)、水稻(OryzasativaL.)、小麦(Triticumaestivum
Linn.)和大麦(HordeumvulgareL.)植物基因工程研
究中[1-3]oBar
基因编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)，其能够使草丁膦的有效
成分膦丝菌素(PPT失活，从而解除除草剂的毒性。Bar基因广
泛应用于基因工程育种中的抗除草剂基因，也是遗传转化中的标记
基因［4］。目前，生物技术育种的阳性转化体筛选多数
依据Bar基因表达的草丁膦除草剂耐受性进行表型鉴定筛选。而
由于其不同时代单个转化体的外源基因表达稳定性未知，表型筛选
易受环境等因素影响，导致了鉴定准确性不高。转基因植物标
记基因的检测方法主要有表型鉴定、PCR鉴定、ELISA和Western
印迹等方法［5］oELISA分析法特异性高，获得结果快，仪器操
作简单，同时可降低检测成本［6-8］。建立Bar基因原核表达体
系，表达和纯化PAT蛋白质可为转基因转化外源蛋白质提供参考，本
研究通过密码子优化和全基因合成，获得了适合原核表达的Bar基
因片段，并分离纯化得到的高纯度PAT蛋白质，可作为抗原为制备多
抗和单抗打下基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株与质粒原核表达载体pET28a（+）、大肠杆菌
抗除草剂Bar基因的优化及PAT蛋白的表达-最新年精选文档--第1页
抗除草剂Bar基因的优化及PAT蛋白的表达-最新年精选文档--第2页
(Escherichiacoli)BL21(DE3和大肠杆菌DH5况由吉林省农业
科学院生物技术研究所转基因安全评价室保存。
1.1.2酶及试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、
dNTPs引物Marker购自宝生物工程（大连）XX公司；氨苄青霉素、
卡那霉素、IPTG十二烷基磺酸钠（SDS和3-巯基乙醇购自Promega
公司；Ni-NTAHisBindResin、层析柱购自北京鼎国昌盛生物技
术有限责任公司。
1.2方法
1.2.1克隆基因片段以合成引物PCF扩增Bar基因全长，然后
用BamHI和Hindm内切酶分别酶切pET-28a载体和扩增片段，将
扩增片段连接PET-28a载体，连接产物转化至DH5况感受态细胞。利
用PCR扩增鉴定阳性质粒，并将阳性重组质粒命名为PET-Bar。提取
质粒pET-Bar并转化到BL21（DE3感受态细胞。挑取含PET-Bar质
粒的单克隆菌落，接种于100mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37
C振荡培养过夜。次日用LB（Amp+稀释至
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