分子生物学研究策略-基因表达技术.pptVIP

（4）杆状病毒表达载体昆虫杆状病毒表达载体系统通常由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成。其技术路线分以下几步:（A）将外源片段克隆到载体质粒中，置于杆状病毒启动子控制之下，上下游各有一段与亲本病毒DNA相匹配的侧翼序列，构建成转移载体；（B）把转移载体和野生型病毒共转染入昆虫细胞，通过同源重组将外源片段插入到病毒基因组，以特定的筛选标记和方法获得重组病毒。（C）当重组病毒在受体细胞内复制时，外源片段也得到了表达。最后空斑纯化重组病毒，扩大培养，分离、纯化所表达的外源蛋白。转移载体构建由于AcMNPV基因组的巨大，不可能用单一的限制性酶切位点来对它进行操作，所以目前使用的杆状病毒表达载体系统大多采用构建转移载体（transfervector）。将病毒非必需基因polh基因克隆到一个大肠杆菌质粒中，利用限制性内切酶和DNA外切酶或者PCR的方法，除去部分或全部polh基因编码序列，保留完整的启动子部分和多角体基因下游序列，即多角体基因侧翼序列，之间加入单一或者多克隆位点，可以插入外源基因。010302杆状病毒分子量大，不能象质粒载体一样利用多克隆位点进行基因重组，而只能利用杆状病毒和带有目的基因序列的质粒载体进行共转染。以野生型杆状病毒ＤＮＡ(ＡＣＭＮＰＶ)进行共转染时重组率极低,仅有0.1%.利用线形化的病毒载体可将重组率提高到30%。在部分载体中引入了β-半乳糖苷酶基因后可以利用插入失活结合蓝白斑进行重组体的筛选。BaculogoldTM是一种缺失衣壳蛋白编码序列ＯＲＦ1629部分序列的缺失致死型突变体,此ＤＮＡ与基于多角体蛋白位点的转移载体对细胞进行共转染时,只有发生同源重组的病毒才有复制能力.果蝇表达系统(Drosophilaexpressionsystem，DES)01包含表达载体和相应的选择载体。通过表达载体和选择载体的共转染,可在3～4周时间内获得表达重组蛋白的稳定转染的细胞系.而且通过优化表达载体和选择载体的比例,可以得到含有高拷贝数目的基因的细胞系,从而提高目的蛋白的表达量。02以前人们认为杆状病毒仅能在鳞翅目昆虫细胞中复制，不能在其他昆虫细胞(如果蝇细胞)中复制，然而研究表明在一定条件下，杆状病毒也能感染果蝇细胞。在果蝇细胞中，杆状病毒的多角体基因启动子几乎不发生作用，利用的是果蝇启动子如Hsp70启动子、肌动蛋白5C启动子、金属硫蛋白基因启动子等，其中，Hsp70启动子的作用最强。重组杆状病毒感染果蝇细胞后不会引起宿主细胞的裂解，且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似，因此，杆状病毒-果蝇系统是一个很有应用前景的昆虫细胞表达系统。所有的昆虫细胞培养基都含有基本盐类，糖类，氨基酸，有机酸，维生素以及微量元素。通常用的商品培养基有Grace培养基，呈粉状。配制培养基的时候要加入10％胎牛血清（FBS）和酵母水解物（YL）和水解乳蛋白（LH）昆虫细胞一般在27℃生长最佳，培养基pH是6.2，无需CO2。多数昆虫细胞的倍增时间是18－22h昆虫细胞的培养基和培养条件4）昆虫细胞培养和重组蛋白表达昆虫细胞比较容易在实验室小规模水平上（100－1000ml），在磁力搅拌瓶中生长，其密度一般可以达到3×106/ml，活力在95％以上。氧的供给：在成批培养的密闭容器中需解决通氧，而且在培养感染重组病毒的昆虫细胞时耗氧量比未感染的要高。细胞保护：由于昆虫细胞对于剪切力和产生气泡的敏感性，细胞容易破裂，化合物PluronicF－68可以保护细胞因上述原因造成的损伤。其它因素：还有好多因素要考虑，如反应器的设计，细胞密度，培养基成分，病毒感染的条件等。3214昆虫细胞的大规模悬浮培养病毒感染和基因表达由于昆虫细胞杆状病毒表达系统生产外源蛋白是一种间歇性的程序进行生产的，因为所有细胞都会因病毒感染而引起病理性死亡，因此，在生产时往往需要至少有两个反应器：第一个反应器培养正常的昆虫细胞，第二个反应器用于病毒接种感染表达。利用杆状病毒的极早期基因ie基因启动子构建转移载体，由于病毒极早期基因启动子的转录可以直接利用宿主细胞的RNApolymeraseII，所以用这样的质粒直接转化昆虫细胞，使昆虫细胞能够持续表达外源蛋白。杆状病毒表达载体系统的新应用广泛用于在昆虫细胞中表达各种重组蛋白。昆虫杆状病毒表达载体系统于20世纪80年代初期问世以来，在20多年的时间里已成为生产与研究各种原核、真核蛋白有力而普及的工具。0102有潜力的应用是病毒表面的蛋白展示功能（proteindisplay）。将外源基因插入到杆状病毒表面糖蛋白gp67的信号肽与成熟蛋白编码序列之间，不破坏它本身的转运及膜融合功能，从而作为载体将外源蛋白展示在病毒粒子表