桑叶提取物中1-脱氧野尻霉素的检测 高效液相色谱法.docxVIP

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桑叶提取物中1-脱氧野尻霉素的检测

高效液相色谱法

1范围

本文件描述了采用高效液相色谱测定桑叶中1-脱氧野尻霉素含量的原理、试剂与材料、仪器与设备、检测方法、结果计算与表示、重复性、精密度和加标回收率。

本文件适用于桑叶提取物中1-脱氧野尻霉素含量的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

芬甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)是一种氨基酸衍生化试剂，主要适用于伯胺和仲胺的衍生化，反应后的衍生物具有较强的紫外吸收，最大吸收波长为254nm。由于1-脱氧野尻霉素(DNJ)分子中有仲胺结构，因此可以采用FMOC-Cl作为衍生化试剂对DNJ进行衍生，利用HPLC对1-脱氧野尻霉素进行定量检测，检测波长为254nm。DNJ与芬甲氧羰酰氯的反应式见图1。

图1DNJ与笏甲氧羰酰氯的反应式

5试剂或材料

除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682一级的水。

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5.1试剂

5.1.1乙腈(C2H3N),色谱纯。

5.1.2冰乙酸(CH3COOH)。

5.1.3芬甲氧酰羰氯(C15H11ClO2)。

5.1.4甘氨酸(C2H5NO2)。

5.1.5硼酸钾缓冲液，pH8.5。

5.2溶液配制

芬甲氧酰氯FMOC-Cl乙腈溶液：称取0.065gFMOC-Cl,精确至0.001g,用乙腈溶解，并定容至50mL,得到5mmol/L的FMOC-Cl乙腈溶液。FMOC-Cl乙腈溶液应现配现用。

5.3标准品

1-脱氧野尻霉素标准品，纯度≥98%。

5.41-脱氧野尻霉素标准储备溶液

称取100mg（精确至0.001g)1-脱氧野尻霉素标准品，置于100mL容量瓶中，用0.01mol/L盐酸

水溶液溶解并定容至刻度线，混匀。

5.51-脱氧野尻霉素标准工作溶液

将1-脱氧野尻霉素标准储备溶液用盐酸水溶液稀释制备一系列标准溶液，标准液浓度分别为

0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL,临用时配制。

5.6材料

滤膜，孔径0.45μm有机相滤膜。

6仪器与设备

6.1分析天平：灵敏度万分之一克。

6.2超声振荡器／超声清洗器：超声频率40kHz~80kHz。

6.3高效液相色谱仪：包含紫外检测器或二极管检测器、色谱工作站。

6.4恒温水浴锅。

7检测方法

7.1样品处理

称取桑叶提取物0.100g试样，精确至0.001g,用0.010mol/L盐酸水溶液超声辅助溶解15min,冷却至室温后，定容至50mL,得到试样溶液。

7.2衍生化反应

取标准品或试样溶液100μL置于1.5mL的离心管中，依次加入0.4mol/L的硼酸钾缓冲溶液(pH8.5)175μL和5mmol/L衍生化试剂FMOC-Cl乙腈溶液250μL,充分混合30s,在25℃恒温水

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浴下反应25min,然后加入0.1mol/L甘氨酸溶液100μL用于中和过量的FMOC-Cl,反应20min,再

加入75μL体积分数为1%乙酸水溶液和300μL去离子水，待反应结束后，用0.45μm有机相滤膜微滤，得到衍生后的样品溶液。样品溶液避光保存备用。

7.3测定条件

按照制造商操作手册运行高效液相色谱仪；以下色谱分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适用性。

色谱条件如下：

—色谱柱：RP-C18(250mm×4.6mmi.d.,5μm);

—流动相：乙腈-0.1%乙酸水溶液(32∶68,体积比）；

—流速：1.0mL/min;

—柱温：30℃;

—进样量：10μL;

—检测波长：254nm。

7.4标准曲线绘制

按7.3色谱条件检测，分别