DB35∕T 1822-2019 水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断技术.docxVIP

ICS11.220B41

DB35

福建省地方标准

DB35/T1822—2019

水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断技术

PCRdiagnostictechniquesfordifferentiatingcircovirusinfectioninwaterfowls

2019-04-18发布2019-07-18实施

福建省市场监督管理局发布

I

DB35/T1822—2019

目次

前言 II

1范围 1

2疫病简述 1

3PCR鉴别诊断 1

附录A（规范性附录）相关试剂的配制 4

附录B（资料性附录）参考序列 6

附录C（资料性附录）PCR检测结果电泳图例 7

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II

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由福建省农业科学院提出。

本标准由福建省农业农村厅归口。

本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心、江西省萍乡市科学技术情报研究所、宁德海关检验检疫技术中心。

本标准主要起草人：傅光华、施少华、黄勇、彭春香、傅秋玲、黄瑜、白泉阳、叶洪、万春和、程龙飞、陈红梅、刘荣昌、陈珍、陈翠腾、朱春华、吴波平、庄晓东。

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水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断技术

1范围

本标准规定了水禽圆环病毒感染PCR鉴别诊断的操作技术要求。

本标准适用于鸭圆环病毒、鹅圆环病毒感染的鉴别诊断。

2疫病简述

水禽圆环病毒（Waterfowlcircovirus）为圆环病毒科圆环病毒属的成员，主要包括鸭圆环病毒（Duckcircovirus,DuCV）和鹅圆环病毒（Goosecircovirus,GoCV），基因组均为环状单股正链DNA。

DuCV可感染不同品种、日龄的鸭，GoCV可感染不同品种、不同日龄的鹅。水禽圆环病毒主要侵害水禽免疫系统，导致宿主免疫应答机能下降，临床上造成被感染动物生长迟缓，并易引起其他细菌和病毒的继发或混合感染。

3PCR鉴别诊断

3.1仪器设备

3.1.1PCR仪。

3.1.2台式冷冻离心机（转速不低于12000r/min）。

3.1.3微量移液器。

3.1.4组织匀浆器。

3.1.5电泳仪。

3.1.6电泳槽。

3.1.7紫外凝胶成像系统。

3.2试剂

3.2.1蛋白酶K。

3.2.210%十二烷基苯磺酸钠（SDS）：配制方法见附录A的A.1。

3.2.3Tris饱和苯酚。

3.2.4酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。

3.2.53mol/L的醋酸钠溶液：配制方法见附录A的A.2。

3.2.6无水乙醇。

3.2.775%乙醇：配制方法见附录A的A.3。

3.2.8溴化乙锭溶液：配制方法见附录A的A.4。

3.2.91×TAE缓冲液：配制方法见附录A的A.5。

3.2.101.0%琼脂糖凝胶：配制方法见附录A的A.6。

3.2.11DNA相对分子质量标准物：100bpladder。

3.2.1210×加样缓冲液：配制方法见附录A的A.7。

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3.3样品的采集与处理

样品的采集与处理依照国家采样标准执行，具体如下：无菌采集生长不良、羽毛紊乱、体况消瘦或发病鸭（鹅）的法氏囊、脾脏等器官，剪碎后与磷酸盐缓冲液（PBS，见附录A的A.8）按体积比1：5的比例制成组织匀浆液，反复冻融3次，8000r/min离心30min，取上清，用于DNA抽提，或置-20℃冻存备用。

若采集的样品需放置6h以上再进行处理，应先置-20℃条件下保存备用，需托运时应确保冷藏或冰冻状态运输。

3.4引物设计

根据水禽（鸭、鹅）圆环病毒两个主要蛋白基因3,之间的间隔序列差异设计3条特异性引物：

CVF：5,-AAYCWCGCGGGAAGTGGTGGGA-3,；

DuCVR：5,-TTCTARGCATAAACGAGATC-3,；

GoCVR：5,-ATAMGATTCGGACAATGGACTG-3,。

其中，CVF为共用上游引物，CVF与DuCVR用于检测DuCV，扩增条带为554bp大小的基因片段，CVF与GoCVR用于检测GoCV，扩增条带为407bp大小的