荧光分光光度计原理与操作课件.pptVIP

荧光分光光度计原理与操作

课程目标与学习内容课程目标1.理解荧光现象的基本原理；2.掌握荧光分光光度计的构造与性能；3.熟悉仪器的操作步骤与参数设置；4.能够进行激发光谱、发射光谱、同步荧光扫描和三维荧光图测定；5.掌握定量分析方法，包括标准曲线法、内标法、外标法和加标回收法；6.能够分析解决仪器使用中常见的问题；7.了解样品准备的技巧与溶剂选择原则；8.掌握仪器的维护保养方法和实验室安全规范。学习内容

什么是荧光现象

荧光的发现历史1早期观察早在16世纪，人们就开始观察到某些物质在特定光照下会发光。例如，一些矿物和植物提取物在太阳光照射下会呈现出特殊的光芒。2斯托克斯的贡献1852年，英国物理学家乔治·加布里埃尔·斯托克斯系统地研究了荧光现象，并提出了斯托克斯定律，解释了荧光发射光的波长总是比激发光长的现象。他也是第一个使用“荧光”（fluorescence）一词来描述这种现象的人。现代发展

斯托克斯定律斯托克斯定律指出，荧光发射光的波长总是比激发光的波长更长。这是因为荧光物质吸收光能后，一部分能量会以热的形式耗散，导致发射光的能量降低，波长增加。换句话说，激发光子的能量高于发射光子的能量。斯托克斯位移是指激发光和发射光之间的波长差，是荧光分析中的一个重要参数。在某些特殊情况下，也会出现反斯托克斯现象，即发射光的波长比激发光短，但这通常需要特殊的条件。

荧光的基本特征激发光谱和发射光谱荧光物质具有特定的激发光谱和发射光谱。激发光谱是指在不同激发波长下，荧光强度随激发波长的变化曲线；发射光谱是指在特定激发波长下，荧光强度随发射波长的变化曲线。通过分析激发光谱和发射光谱，可以识别和定量分析荧光物质。荧光强度与浓度关系在一定浓度范围内，荧光强度与荧光物质的浓度成正比。利用这一关系，可以建立标准曲线，进行定量分析。但是，当浓度过高时，由于内滤效应和猝灭效应，荧光强度与浓度的线性关系会受到影响。荧光寿命荧光寿命是指荧光物质在停止激发光照射后，荧光强度衰减到初始值的1/e（约36.8%）所需的时间。荧光寿命是荧光物质的一个重要特征参数，可以用于区分不同的荧光物质，也可以用于研究分子间的相互作用。

荧光发射过程示意图荧光发射过程通常包括三个步骤：1.激发：荧光物质吸收激发光子的能量，从基态跃迁到激发态；2.振动弛豫：激发态分子通过振动弛豫，降低到激发态的最低振动能级；3.荧光发射：激发态分子从最低振动能级跃迁回基态，同时发射出荧光光子。荧光发射过程的时间非常短，通常在纳秒级别。理解荧光发射过程有助于更好地理解荧光的特性和应用。

荧光量子产率1定义荧光量子产率是指荧光物质发射的荧光光子数与吸收的激发光子数之比。它是一个衡量荧光效率的重要指标，取值范围在0到1之间。量子产率越高，表明荧光物质的荧光效率越高。2影响因素荧光量子产率受多种因素的影响，包括荧光物质的结构、溶剂、温度、pH值以及是否存在猝灭剂等。不同的荧光物质在不同的条件下，其量子产率可能会有很大的差异。3测定方法荧光量子产率可以通过比较法或直接法进行测定。比较法是利用已知量子产率的标准荧光物质作为参考，测定未知荧光物质的量子产率；直接法是直接测量荧光物质吸收的光子数和发射的光子数，计算量子产率。

荧光寿命概念定义荧光寿命是指荧光物质在停止激发光照射后，荧光强度衰减到初始值的1/e（约36.8%）所需的时间。荧光寿命是一个反映荧光分子激发态存在时间长短的参数，通常在纳秒级别。影响因素荧光寿命受多种因素的影响，包括荧光物质的结构、溶剂、温度、pH值以及是否存在猝灭剂等。不同的荧光物质在不同的条件下，其寿命可能会有很大的差异。应用荧光寿命可以用于区分不同的荧光物质，也可以用于研究分子间的相互作用，例如荧光共振能量转移（FRET）。荧光寿命成像显微镜（FLIM）是一种利用荧光寿命进行成像的技术，可以提供关于细胞和组织微环境的信息。

影响荧光强度的因素浓度荧光强度与荧光物质的浓度在一定范围内成正比，但浓度过高时会出现内滤效应和猝灭效应，导致线性关系偏离。1温度温度升高通常会导致荧光强度降低，因为高温会加速激发态分子的非辐射跃迁过程。2pH值pH值会影响荧光物质的质子化状态，从而影响其荧光强度。不同的荧光物质对pH值的敏感程度不同。3溶剂溶剂的极性和粘度会影响荧光物质的激发态寿命和非辐射跃迁速率，从而影响荧光强度。4

温度对荧光的影响1高温非辐射跃迁速率加快，荧光强度降低。2室温荧光强度适中，有利于实验操作。3低温荧光强度增强，但可能影响样品溶解度和实验操作。温度对荧光强度的影响主要是通过改变激发态分子的非辐射跃迁速率来实现的。高温会加速非辐射跃迁过程，导致荧光强度降低；低温则会抑制非辐射跃迁过程，增强荧光强度。在实际应用中，需要根据具体的实验要求选择合适的温度。

pH值