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DNA连接实验原理

(2008-03-3118:21:51)

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dna连接

实验原理

杂谈

ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下，由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟

基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。

带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源

DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA的浓度，以

便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身

环化。利用T4DNA连接酶进行目的DNA和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3’羟基之

间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱

磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。

1、不对称粘性末端：两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点

常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。

2、对称性粘性末端；线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；

重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。

3、平端：要求高浓度的DNA和连接酶；载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA

的串联拷贝；非重组克隆的背景较高。

粘性末端连接：

实验试剂：

用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮ

Ａ。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。

10×T4DNA连接酶buffer（该缓冲液应分装成小份，贮存于－20℃。）：200mMTris-HCl(pH7.6)；50mMMgCl2；

50mM二硫苄糖醇；

500μl/mlBSA（可用可不用）

T4DNA连接酶

5mMATP

实验步骤：

1、在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：

1)10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA

分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O至8μl。

2)轻轻混匀，稍加离心，于45℃水浴５分钟使重新退火的粘端解链，迅速将混合物转入冰浴。

3)加入含ATP的10×Buffer1μl，T4DNA连接酶合适单位，用ddH2O补至10μl。

2、盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。

3、１２℃下过夜连接反应。

4、反应结束后于－２０℃保存。

5、再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，

每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。可用

至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。

注意事项：

1、连接反应的温度：ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，

折衷方法是１２℃过夜。

2、DNA的平未端和粘性末端：由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端

连接和粘性末端连接。二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的。

3、碱性磷酸酶处理质粒载体：为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出

现ＤＮＡ自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过

接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。

4、连接反应的检测：连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌，阳性克隆的筛选来确定。

5、如果要检验连接酶和连接酶专用的缓冲液是否有效，可重新连接酶切后的λDNA。若连接成功，则说明有效。

连接反应的影响因素：

1、连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HC，较多用50mmol/L，pH的范围

在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，