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SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法
定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为一个活
力单位。
按照GB/T5009.171-2003中邻苯三酚自氧化的方法测定酶活力，
-
利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O，生成带色的中
2
间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维
持在3~4min。加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的
吸光度。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速
率达50%时的酶定量为一个活力单位。
一、试剂：
1、pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液：
A液:称取17.9gNaHPO•12HO于容量瓶中定容至1L；
242
B液:称取7.8gNaHPO•2HO于容量瓶中定容至1L；
242
取A液91.5mL和B液体8.5mL混匀得到pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓
冲液。
2、C液:pH8.20，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液
(内含1mmol/LEDTA•2Na)：
称取1.2114gTris和37.2mgEDTA•2Na溶于62.4mL0.1mol/L盐酸溶
液中，用蒸馏水定容至100mL。
3、0.lmol/L盐酸溶液:量取2.lmL12mol/L盐酸，蒸馏水定容至250mL。
4、.10mmol/L盐酸溶液:量取10mLO.lmol/L盐酸，蒸馏水定容至l00mL。
5、D液:4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液：
称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量的10mmol/L的盐酸溶液，并定
容至100mL。
二、仪器：
1.冷冻离心机
2.水浴锅；
3．电子天平；
4．紫外-可见分光光度计；
5．精密酸度计，精确到0.01pH；
6．10mL比色管；
7．10mL离心管；
8．玻璃乳钵。
三、实验步骤
1．SOD粗酶液的提取
称取叶片1g，置于研钵中研磨，加入3mL0.05mol/L磷酸缓冲液，
加入少量石英砂，继续在冰浴中的研钵内研磨成匀浆，取4mL至离心
管中，于4℃10000r/min离心20min，上清液即为SOD粗提液。
2.1邻苯三酚自氧化速率测定
在25℃左右，于10mL比色管中依次加入C液体2.35mL，磷酸缓冲液
2.00mL,D液0.15mL。加入D液后立即混合均匀并倾入比色皿，分别测
定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚
-1
自氧化速率ΔA(min)。
325
2.2样液抑制邻苯三酚自氧化速率测定
样液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按照2.1步骤分别加入一定量
-1
样液使抑制邻苯三酚自氧化速率约为1/2ΔA(min)，即Δ
325
-1
A(min)。
325
SOD活性测定加样表
试液空白酶提取液1酶提取液2
C液/mL2.352.352.35
磷酸缓冲液/mL21.51.5
样液/mL00.50.5
D
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