流式细胞检测技术讲座.pptVIP

FACSCanto光学滤片检测器组（激光器）PMT位置带通/长通透镜适用染料八角形（488nm蓝色激光）A780/60PE-Cy7B670LPPerCP-Cy5.5,PerCPC585/42PE,PID530/30FITC三角形（633nm红色激光）A780/60APC-Cy7B660/20APC第31页，共46页，星期日，2025年，2月5日FACSAria光学滤片检测器排列（激光器）光电倍增管BP滤光片可用染料八角形（488nm蓝色激光）A780/60PE-Cy7B695/40PerCP-Cy5.5,PerCPC610/20PE-TexasRedD575/26PEE530/30FITC三角形（633nm红色激光）A780/60APC-Cy7B660/20APC三角形（407nm紫色激光）A530/30AlexaFluor430B450/40CascadeBlue,PacificBlue,DAPI,Hoechst,AlexaFluor405第32页，共46页，星期日，2025年，2月5日荧光染色对照阳性对照使用已知阳性样本，帮助排除试剂的质量、浓度、特异性以及染色方法等因素阴性对照空白对照（自发荧光）自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高，自发荧光越强。实验样本（自发荧光＋特异荧光＋非特异荧光）特异荧光，即抗体F(ab’)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光同型对照（自发荧光＋非特异荧光）第33页，共46页，星期日，2025年，2月5日同型对照同型对照（IsotypeControl）：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型与染色的单克隆抗体①相同种属来源②相同免疫球蛋白及亚型③相同荧光素标记④相同剂量和浓度⑤但由未免疫动物血清纯化而来用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（γ1）和IgG2a（γ2a），并分别标记FITC和PE第34页，共46页，星期日，2025年，2月5日关于流式细胞检测技术讲座第1页，共46页，星期日，2025年，2月5日主要内容流式细胞技术概念流式细胞技术原理流式实验的设计流式细胞技术在临床科研上的应用第2页，共46页，星期日，2025年，2月5日流式细胞技术概述流式细胞技术的概念流式细胞技术的特点流式细胞仪的检测范围BD公司流式细胞仪流式细胞仪的结构第3页，共46页，星期日，2025年，2月5日什么是FCM？流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术激光技术+流体力学+光电测量技术+计算机技术+细胞荧光化学技术+单克隆抗体技术第4页，共46页，星期日，2025年，2月5日FCM的特点测量速度快：最快可在1秒种内检测上万个细胞可进行多参数测量：可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量具有明显的统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况高分辨率(CV2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度≤100MESF，前向角散射光检测灵敏度(0.2～0.5um)既是细胞分析技术，又是精确的分选技术，分选纯度可达99%以上第5页，共46页，星期日，2025年，2月5日流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体第6页，共46页，星期日，2025年，2月5日BD公司流式细胞仪FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAria第7页，共46页，星期日，2025年，2月5日流式细胞仪的结构光路：1、激光光源及光束成形系统：氩离子(488nm)红