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新型果蔬农药残留生物降解制剂

自20世纪70年代以来，随着农药的大规模使用，农产品上的农药残留问题变得越来越严重，探索出一条能高效治理农药残留的新途径就成为了现代科学工作者十分关注的课题。许多学者认为，在解决业已存在的农产品农药残留方面，生物处理具有无可比拟的优势(DeLorenzo,2001)。由于生物降解技术具有良好的发展前景，近年来国内外相关研究机构都加大力度研究开发新型的农药残留微生物降解制剂。而国内对农药微生物降解研究起步较晚，主要集中在环境中农药残留生物降解菌的筛选、降解特性研究等基础层面，应用于农产品残留处理的研究则相对较少，目前尚未见有成熟的产品应用，直接应用于农产品残留的甚至尚未见系统深入的报道。

本产品应用了以生物修复（bioremediation）为理论基础的农药残留降解菌技术，通过筛选出既高效又对哺乳动物和环境友好的降解菌，开发形成了新型果蔬农药残留生物降解制剂。生物修复技术，即利用生物体（特别是微生物）的生命代谢活动来降低被污染环境中的有毒、有害物质的浓度或使其无害化，从而使污染的环境能够部分或完全地恢复到原初状态的过程。农药生物降解技术具有高效、无毒、无二次污染、经济实用、应用范围广的特点，且操作简便，具有极大的实用性和发展空间。

第一部分生物降解制剂高效降解菌种的筛选

1材料与方法

1.1供试微生物

从2004年1月开始，分别从贵州省遵义市鸡顶山取回贫营养土样和水样、中山凯达精细化工厂废水处理池中取回未处理污泥和废水样品，在培养基中添加拟毒死蜱和高效氯氰菊酯原药，自主分离筛选获得单一纯化真菌菌落，分别编号，测定各菌种对农药的降解效能。取同等条件下农药降解率最高的菌株，进行分离培养和进一步研究。筛选获得的高效降解菌种采用液体石蜡保存法和砂土保存法保存于华南农业大学昆虫毒理研究室胡美英教授课题组。

1.2培养基种类的筛选

将预培养3d的降解菌培养液于4800rpm离心10min，取0.1g湿菌体在无菌条件下分别接入装有50ml下述5种不同培养基的250ml三角瓶，置于气浴恒温振荡器中（28℃，150rpm）振荡培养5d后，将培养物用双层滤纸过滤，然后用蒸馏水清洗3遍，菌体连同滤纸干燥后称重，减去干燥滤纸质量，得菌体干重。以同等条件下菌丝体干重为指标，选择降解菌合适的培养基（方中达，1999）。

1.3降解菌分离筛选和形态及分子鉴定

采用平板稀释法和富集培养法分离纯化得到降解菌，测定菌种对高效氯氰菊酯和毒死蜱降解率，获得高效降解菌株(王兆守等,2003)。参考文献(王兆守等，2003)，利用HPLC法测定高效氯氰菊酯和毒死蜱残留量，计算菌株对供试药剂的降解率（％）=（对照农药残留量－处理农药残留量）/对照农药残留量×100

菌种的初步鉴定参考文献方法(方中达，1999；中国科学院中国孢子植物志编辑委员会，2003)及微生物教材，显微镜下观察各种降解真菌孢子、孢子囊、孢囊梗、分孢器等形态学特征，测量相关指标，根据初步形态观察，初步鉴定各种降解真菌归属。

采用分子生物学的方法鉴定筛选所得菌种。抽提DNA，ITS扩增及产物割胶纯化，用pTA2载体克隆该片段，挑单菌落培养后送去公司测序，分析测序结果。

2结果与分析

2.1降解菌株筛选结果

采用筛选降解菌的平板稀释法和富集培养法，以高效氯氰菊酯和毒死蜱为唯一碳源的高效氯氰菊酯-毒死蜱-查彼氏培养基，从供试样品污泥中分离、筛选和纯化降解真菌菌株，初步分离纯化得到8个菌株能在培养基上生长，并利用HPLC分析测定8个降解真菌菌株对培养液终浓度为100mg/L高效氯氰菊酯和毒死蜱的降解率，结果表明，处理后24h，降解菌株01、02、03对高效氯氰菊酯的降解率分别为91.40％、89.30％和86.00％，对毒死蜱的降解率分别为85.14％、42.50％和30.61％（表1.1），对高效氯氰菊酯降解活性较高于对毒死蜱。真菌菌株04~08处理后，对高效氯氰菊酯降解率分别为62％~77%，对毒死蜱降解率为10％~60%，DMRT法统计表明，菌株01对氯氰菊酯的降解效果最好，菌株02、03处理降解率显著高于其他真菌菌株，可进一步深入研究以证明其降解效果(表1.1),其中菌株01对高效氯氰菊酯的降解液相色谱图（见图1.1。

图1.1菌株01降解高效氯氰菊酯HPLC色谱图24h(50mg/L)

表1.1降解菌对高效氯氰菊酯的初步筛选及鉴定结果

菌种编号

干菌丝重(g)

高效氯氰菊酯降解率(%)

毒死蜱降解率(%)

初步鉴定归属

01

0.35±0.0093a

91.40±0.26a

85.14±1.02a

枝孢霉属Cladosporiumsp.

02

0.35±0.0058a

89.