柴胡根腐病菌鉴定方法FDIS.docx

B38

DB1302

唐山市地方标准

DB1302/T474—2017

柴胡根腐病菌鉴定方法

2017-12-20发布2018-01-01实施

唐山市质量技术监督局发布

DB1302/T474—2017

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由唐山市质量技术监督局提出。

本标准起草单位：唐山师范学院。

本标准主要起草人：客绍英、姜峰、马艳芝、王晓英、段英姿、张胜珍。

DB1302/T474—2017

柴胡根腐病菌鉴定方法

1范围

本标准规定了柴胡根腐病菌（FusariumsolaniWill）鉴定的方法原理、仪器设备和试验用具、试

剂和培养基、田间取样、病原菌的分离与培养、病原菌形态学鉴定及病原菌特征判断、分子生物学鉴定、结果判定等。

本标准适用于镰刀菌属为主要致病菌的柴胡根腐病菌检测和鉴定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ITS（InternalTranscribedSpacer）：内转录间隔区PCR（PolymeraseChainReaction）：聚合酶链式反应

BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）：局部序列比对基本检索工具

4方法原理

根据茄腐镰刀菌在柴胡根茎交界处的症状、病原菌的形态特征、生物学特性和PCR特异性反应对病原菌进行鉴定。

5仪器设备和试验用具

显微镜、超净工作台、恒温培养箱、冰箱、高压灭菌锅、高速冷冻离心机、PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、微量移液器、载玻片、盖玻片、滴管、培养皿、镊子、解剖刀、酒精灯、医用解剖剪等。

6试剂和培养基

无菌双蒸水、液氮、蛋白酶K、盐酸、氢氧化钠、乙酸铵、氯化钠、TAE缓冲液、无水乙醇、溴化乙锭、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、TE缓冲液（pH8.0）、PCR试剂（包括TaqDNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液）、葡萄糖、五氯硝基苯（PCNB）、硫酸链霉素、20%乳酸、除另有规定外，所有试剂均为分析纯，所有试验用水均为无菌双蒸水。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和PCNB酸性马铃薯葡萄糖选择性培养基培养基，配制方法见附录A。

7田间取样

重点检查根茎交界处，病症是在根茎交界处根组织变粗，颜色变深，质地变脆，并且在表面有裂隙。

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将可疑发病柴胡植株连根拔出，轻轻抖动去除表土，送实验室做进一步的检验。取样方法和步骤按SN/T2122规定执行。

8病原菌的分离与培养

切取病健交界部位组织（约0.5cm×0.5cm），用0.1%次氯酸钠溶液等消毒液表面消毒5min～10min（根据分离组织的腐败程度可以适当增加或缩短表面消毒时间），无菌水冲洗2次～3次，用无菌滤纸吸干水分后，在无菌操作条件下，置于PCNB酸性马铃薯葡萄糖选择性培养基平板上，25℃~28℃培养2d~3d。发现有灰白色菌丝长出，立即挑取菌落边缘菌丝，转入PDA平板纯化并保存。

9病原菌形态学鉴定及病原菌特征判断

将分离获得的候选真菌分别在PDA培养基上25℃培养7d，观察菌落形态、颜色；用显微镜观察候选真菌分生孢子形态、隔膜有无及数目、产孢结构、厚垣孢子有无及着生部位等。

病原菌在PDA培养基上蔓延生长，菌丝呈白色绒毛状，不易产孢子。镜检可以看见大量分生孢子和分生孢子梗。分生孢子梗伸长、不分枝；小型分生孢子长椭圆形、肾形，单胞或双胞，数量大，呈假头状聚生；大型分生孢子镰刀形，两端较钝，顶胞稍弯，具1隔～6隔，其中3隔膜占总数的99%以上；厚垣孢子球形，表面光滑或粗糙，顶生或间生于菌丝中。见附录B。

10分子生物学鉴定

形态学鉴定后还需进行PCR鉴定，PCR鉴定方法见附录C。茄腐镰刀菌通用引物ITS1和ITS4的序列见附录D。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下从凝胶中切取目标条带并测序分析。

测序结果经BLAST(/blast)与NCBI数据库中的已知序列进行同源性比较。

11结果判定

根据茄腐镰刀菌的鉴定特征和PCR比对结果对病原菌分离物进行综合判断，如病原菌特征符合第9章的描述，并且序列比对相似度与已报道的茄腐镰刀菌超过99%，可以确定为茄腐镰刀菌。

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