定量与常规PCR的差别.pptxVIP

定量与常规PCR的差别Opticon实时荧光定量PCR仪之常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析三个关键词：实时，定量，荧光

Opticon实时荧光定量PCR仪之Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。为什么要用Ct值定量实时荧光定量PCR方法利用循环阈值（Ct）的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。如何定量？Ct值的概念

定量原理初始DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度Opticon实时荧光定量PCR仪之

SYBRGreen1MolecularBeaconsTaqMan荧光化学Opticon实时荧光定量PCR仪之

AmplifluorRoche荧光化学Opticon实时荧光定量PCR仪之阴阳探针R1R2RQ

SYBRGreenI工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之SYBRGreen1结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen1染料只有和双链DNA结合后才发荧光。GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA

GTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACGGTAAT变性DNA未结合SYBRGreen1dye变性:无荧光信号SYBRGreenI工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之

SYBRGreenI应用范围起始模板浓度定量融解曲线分析---可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体基因型分析Opticon实时荧光定量PCR仪之

SYBRGreenI优点使用方便---不必设计复杂的引物没有序列特异性---可以用于不同的模板便宜灵敏Opticon实时荧光定量PCR仪之

Opticon实时荧光定量PCR仪之01SYBRGreenI缺点02与非特异性产物结合

Molecular

BeaconsMolecularBeaconsOpticon实时荧光定量PCR仪之发夹型杂交探针

MolecularBeacons原理：荧光谐振能量传递（FRET）茎由互补配对的序列组成环与目标序列完全配对茎Opticon实时荧光定量PCR仪之荧光素淬灭剂环

变性:产生非特异性的荧光MolecularBeaconsOpticon实时荧光定量PCR仪之

MolecularBeaconsSNPTACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQ荧光素目标序列茎淬灭剂Opticon实时荧光定量PCR仪之

延伸:没有荧光MolecularBeaconsSNPOpticon实时荧光定量PCR仪之

Opticon实时荧光定量PCR仪之MolecularBeacons应用范围定量起始模板浓度基因型分析鉴定产物单核苷酸多态性（SNP）检测

MolecularBeacons优点对目标序列有很高的特异性用于SNP检测的最灵敏的试剂之一荧光背景低Opticon实时荧光定量PCR仪之

Opticon实时荧光定量PCR仪之设计困难无终点分析功能只能用于一个特定的目标价格较高MolecularBeacons缺点

TaqMan探针荧光素淬灭剂Opticon实时荧光定量PCR仪之TaqMan水解型杂交探针

TaqMan目标特异性探针5’为荧光素，3’为淬灭剂5’荧光素3’淬灭剂与目标序列互补Opticon实时荧光定量PCR仪之

TaqMan工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之退火:无荧光信号3’3’5’5’模板和探针杂交

延伸:聚合反应5’5’3’3’TaqMan工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之

3’3’5’5’延伸:Taq酶切下5’端荧光素出现荧光TaqMan工作原理Opticon实时荧光定量PCR仪之

TaqManSNP分析TACCGGGGGTTACGAACGGTAATGATCCTACCGATCCCACCOpticon实时荧光定量PCR仪之

Opticon实时荧光定量PCR仪之TaqMan应用范围基因型分析SNP分析定量起始模板浓度产物鉴定

Opticon实时荧光定量PCR仪之对目标序列有很高的特异性--特别适合于SNP检测与Molec