DB12_T1271-2023_有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法_天津市.docxVIP

ICS65.080

CCSB10

12

天津市地方标准

DB12/T1271—2023

有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR

法

RapiddetectionofliveEscherichiacoliinorganicfertilizerbyPMA-qPCRmethod

天津市市场监督管理委员会

发布

DB12/T1271—2023

前

言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。

本文件起草单位：天津市农业科学院畜牧兽医研究所、农业农村部环境保护科研监测所。

本文件主要起草人：张蕾、田雪力、池晶晶、路超、杨春蕾、韩静、王丽丽、白朋勋。

I

DB12/T1271—2023

有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法

1

范围

本文件规定了有机肥中活性大肠杆菌PMA-qPCR测定方法的试剂与引物、主要仪器设备、样品采集、

检测步骤和检测结果等技术内容。

本文件适用于有机肥中活性大肠杆菌的检测。

2

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682

分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19438.1禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T525

有机肥料

3

liveEscherichiacoli

在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染的致病菌。

光反应

4

缩略语

5

1

DB12/T1271—2023

PMA是光敏DNA染料，可与DNA发生不可逆的共价交联反应。PMA无法透过活性细菌完整的细胞膜，但

可以进入死亡细菌受损细胞膜，并永久修饰其DNA，阻断DNA的PCR扩增。在强光照射下，游离在溶液中

未与核酸交联的剩余PMA可与水分子反应，生成没有活性的羟胺。羟胺不会对后续从活细菌提取的DNA

进行修饰，不影响DNA正常扩增。

样品经PMA预处理后再进行DNA提取及PCR扩增，可以克服常规PCR无法区分活性细菌与死亡细菌释放

出的游离DNA的缺陷，有效避免PCR检测中的假阳性结果。

6

试剂与引物

试剂

6.1

6.1.1

除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T6682中二级水的要求。

6.1.2PMA储备液（5μg/μL）：1mgPMA溶于200μL20%的DMSO溶液中，-20℃避光保存。

6.1.3PMA工作液：将PMA储备液以20%DMSO溶液稀释10倍。

6.1.40.01mol/L（pH7.2）PBS：配方见GB/T19438.1附录A。

6.1.595%乙醇。

6.1.6DNA提取试剂盒。

6.1.7SYBRPremixExTaq染料法实时荧光定量试剂盒：内含TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg，

2+

TliRNaseH，SYBRGreenI。根据qPCR仪型号选用ROX或ROXII校正。

6.1.8qPCR标准品：含有目的基因的克隆质粒，也可采用经纯化后的基因组DNA。

6.2

引物

大肠杆菌uidA基因qPCR扩增所用引物见表1。

表1大肠杆菌uidA基因qPCR扩增引物

扩增产物大小

167bp

7

超净工作台、冰箱（0℃～4℃）、分析天平（精度0.01g）、恒温震荡培养箱、LED光解仪（波长

465nm～475nm、温度低于37℃）、低温离心机（最大离心力≥12000g）、微型孔板离心机、漩涡震荡

器、核酸自动提取仪、qPCR仪、超微量分光光度计等。

8

8.1

8.2

8.3

2

DB12/T1271—2023

样品在运输过程中宜低温保存，应在6小时内送至实验室进行检测。实验室接样后不能立即检测的，

应将样品放入0℃～4℃冰箱保存，放置时间不应超过24h。

9

检测步骤

9.1

样品制备

将样品进一步缩分后研磨至全部通过?1mm尼龙筛，混匀。无菌操作下称取样品10.0g，加入到带玻

璃珠的90mL无菌PBS缓冲液中，置于恒温震荡培养箱中，200r/min震荡30min。于4℃，1000×g离心10min

收集上清液。

9.2PMA处理

取1mL上清液至离心管中，加入0.2mLPMA工作液，PMA终浓度约为80μg/mL，避光放置10min。将

离心管置于LED光解仪，曝光5min。再将离心管于4℃，12000×g离心5min，弃上清液，无菌PBS缓冲液

洗