DB45T 2311-2021 牛传染性鼻气管炎病毒的检测 巢式聚合酶链反应法.docxVIP

ICS11.220CCSB41

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广西壮族自治区地方标准

DB45/T2311—2021

牛传染性鼻气管炎病毒的检测巢式聚合

酶链反应法

Detectionofinfectiousbovinerhinotracheitisvirus—Nestedpolymerasechainreaction

2021-04-25发布2021-05-31实施

广西壮族自治区市场监督管理局发布

II

DB45/T2311—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内家可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广西壮族自治区农业农村厅提出并宣贯。

本文件由广西畜牧业标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：广西壮族自治区兽医研究所。

本文件主要起草人：范晴、张民秀、王盛、李小凤、李丹、万丽军、阮志华、任红玉。

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DB45/T2311—2021

牛传染性鼻气管炎病毒的检测巢式聚合酶链反应法

1范围

本文件规定了巢式聚合酶链反应法检测牛传染性鼻气管炎病毒的材料准备、操作方法及结果判定。本文件适用于广西行政区域内牛传染性鼻气管炎病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T31190实验室废弃化学品收集技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

牛传染性鼻气管炎病毒infectiousbovinerhinotracheitisvirus属疱疹病毒科，水痘病毒属，基因组为双链DNA。

3.2

聚合酶链反应polymerasechainreaction

简称PCR技术，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。3.3

巢式PCR反应nestedpolymerasechainreaction

简称NestedPCR，PCR技术的一种特殊形式，在常规PCR扩增的片断内再设计一对新的引物，对常规PCR的产物进行二次PCR扩增，扩增出比常规PCR更短的产物，可显著提高其检测的敏感度。

3.4

引物primers

与待扩增DNA片段两侧互补的一小段寡核苷酸。3.5

外套引物outerprimers用于第一次PCR的引物。

3.6

内套引物innerprimers用于第二次PCR的引物。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

IBRV：牛传染性鼻气管炎病毒（infectiousbovinerhinotracheitisvirus）

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DB45/T2311—2021

PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction）

5材料准备

5.1IBRV特异性引物

引物序列见附录A中的A.1.1。外套引物F1和F2扩增的目的片段为416bp，内套引物F3和F4扩增的目的片段为334bp，引物使用浓度均为50pmol/μL，置于-20℃保存。

5.2试剂

5.2.1DNA抽提试剂

如下：

——TrizolDNA抽提试剂1)(或其它等效抽提剂)；——氯仿；

异丙醇；

——75％乙醇；——100％乙醇；

——0.1mol/L柠檬酸钠乙醇；——8mmol/LNaOH。

5.2.2PCR试剂盒

如下：

——TaqDNA聚合酶；

——dNTPs混合物：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP；——10倍PCR缓冲液（含Mg2+）。

注：试剂盒包含了PCR扩增所必需的各种酶、dNTPs及Mg2+等全部试剂。5.2.3电泳试剂

如下：

——1％琼脂糖；

——10g/mL核酸染料；——加样缓冲液；

——1倍TAE电泳缓冲液。5.2.4其它试剂

如下：

——灭菌双蒸水；

——磷酸盐缓冲液（PBSpH7.2)。

1)Trizol?DNA抽提试剂（商品名）是由Invitrogen公司（供应商）提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对