生物化学：第35章 基因工程与蛋白质工程简介.ppt

20世纪70年代早期主要利用天然质粒，1977年Bolivar等构建成功pBR322,1982年Viera和Messsing构建成功pUC系列质粒，随后有不少穿梭质粒，表达质粒等问世。2.pBR322pBR322是由几个质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的克隆载体，分子的长度为4363bp。具有氨苄青霉素和四环素两种抗药性标记。pBR322共有24种限制性内切酶的单一识别位点，其中7种酶(ecoRV,NheI,BamHI,sphI,salI,XmaⅢ,NruI)的识别位点位于四环素抗性基因内部，2种酶(ClaI,HindⅢ)的识别位点存在于这个基因的启动子内部。所以在这9个限制性位点上插入外源DNA通常都会导致抗四环素基因(tetr)的失活。3种酶(scaI,PvuI,PstI)在氨苄青霉素抗性基因(ampr)内具单一的识别位点，在这3个位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。若将外源基因插入tetr基因，将构成的重组质粒转入对四环素和氨苄青霉素均敏感的受体菌，则在含氨苄青霉素的平面培养基上生长，而在含四环素的平面培养基上不生长的菌落均含有外源基因。适合于蓝白选择2.pUC载体系列是由大肠杆菌pBR322质粒与M13噬菌体改建而成的双链DNA质粒载体，含有来自pBR322质粒的复制起点(ori)，氨苄青霉素抗性基因(ampr)以及大肠杆菌β半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码α肽链的基因，在lacZ基因中有一个多克隆位点(MCS)区段。当外源的DNA片段插入到这些克隆位点使α互补链破坏时，形成的是无活性的β-半乳糖苷酶，被转化的大肠杆菌细胞，在Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)-IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)培养基上形成白色菌落，而没有外源DNA插入的质粒转化大肠杆菌细胞后，在Xgal-IPTG培养基上形成蓝色菌落。pUC质粒载体比pBR322具有更小的相对分子质量，而且由于rop基因的缺失(其基因产物ROP蛋白，控制质粒复制)，使得其拷贝数大增，每个细胞可达500-700个拷贝，因此由pUC质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。pUC18和pUC19的唯一差别是多克隆位点的方向相反。Xgal可被β-半乳糖苷酶水解生成深兰色的5-溴-4-靛兰，IPTG可诱导β-半乳糖苷酶α-链的合成。3.λ噬菌体λ噬菌体的基因组是长度约为50kb的线性双莲DNA分子。在其两端，各有一条由12个核苷酸组成的互补粘性末端。当λ噬菌体DNA进入寄主细胞后，线性DNA分子通过粘性末端的碱基配对而结合，形成环状DNA分子。这种由粘性末端结合形成的双链区段为cos位点。现用的λ噬菌体载体都是在野生型基础上改造而成的。改建之后的常用载体有两类：①插入型载体，具有一个可供外源DNA插入的克隆位点，如λgt10、λgt11；②替换型载体，具有成对的克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段可被外源插入的DNA片段取代，如charon4、charon10、charon35。插入型载体只能插入较小的外源DNA片段(＜10kb)，而替换型载体能插入较大的外源DNA片段(20-24kb左右)。当重组体DNA分子大于λ噬菌体基因组105%或小于75%时，重组噬菌体的活力会大大下降，不能形成正常大小的噬菌斑，所以重组体DNA分子长度应控制在包装限度范围内。λ噬菌体重组体分子不具有抗生素抗性选择标记，主要是依据噬菌斑的形态学特征和Xgal-IPTG显色反应来筛选重组子。cI基因的存在将使λ噬菌体进入溶源状态，因此在培养基上形成的是混浊型的噬菌斑。cI基因失活或缺失的λ噬菌体在培养基上形成清亮型噬菌斑。根据这个形态学特征可筛选λ重组体分子。许多λ载体，如charon2、λgt11含有编码β半乳糖苷酶基因lacZ(其中引入多克隆位点)。由这种载体感染的大肠杆菌lac-菌，涂布在含有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色噬菌斑。当外源DNA片段插入到这些克隆位点时，寄主细胞就会在Xgal-IPTG培养基上形成无色噬菌斑，如果在替换型载体的可替换区段含有lacZ基因序列，也会出现同样结果。4.Cosmid质粒黏粒载体本身长4-6kb，具有质粒和λ噬菌体两种载体的性质，能像质粒一样复制及转化细菌，在细菌中其增殖与质粒复制一样，产生的重组子是菌落而不是噬菌斑，同时也具有λ噬菌体的cos位点，能与λ噬菌体一样在体外被包装成病毒颗粒并感染宿主菌，但是由于在黏粒中克隆基因组文库要比在λ噬菌体中困难得多，只有在靶基因过大，不能作为单个DNA区段在λ噬菌体载体中克隆增殖，或者要分离一系列跨过染色体DNA特大区段的重叠克隆