DB22_T2788-2017_猫泛白细胞减少症诊断实时荧光PCR法_吉林省.docxVIP

ICS11.220

DB22

B41

吉林省地方标准

DB22/T2788—2017

猫泛白细胞减少症诊断实时荧光PCR法

ThediagnosticofFelinepanleukopeniavirusReal-timePCRmethod

吉林省质量技术监督局发布

DB22/T2788—2017

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院、吉林农业大学、吉林省动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：程荣华、呼延含蓉、王开、郭衍冰、王楠、丁世杰、邵洪泽、于钦磊、白翠、

李昱洁、陆伟、何浩、刘沂霖、赵欣、肖玉海、王辉。

I

DB22/T2788—2017

猫泛白细胞减少症诊断实时荧光PCR法

1

范围

本标准规定了猫泛白细胞减少症实时荧光PCR方法的缩略语、材料、操作步骤和结果判定。

本标准适用于猫泛白细胞减少症的实验室诊断。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682

分析实验室用水规格和试验方法

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

Ct：循环阈值（Cyclethreshold）

高速冷冻离心机，12000r/min以上。

1

DB22/T2788—2017

4.2.71000mL量筒。

4.2.81000mL容量瓶。

4.2.9PCR八联排管。

4.2.10吸头，10μL，200μL，1000μL。

4.2.11医用棉签。

4.3试剂

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。

4.3.10.02mmol/LPBS，见附录A。

4.3.2基因组DNA提取试剂盒。

4.3.3SYBRPremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（2×）。

4.3.4灭菌双蒸水。

4.4引物

上游引物F：5-AATGCTTGGGGAGTTTGGTTT-3。

下游引物R：5-TTTAGTTGGTGGCTGAGTAGCAGA-3。

5操作步骤

5.1采样器具前处理

组织匀浆器或研钵（4.2.1）、医用剪刀（4.2.2）、镊子（4.2.3）经160℃干热灭菌2h。

5.1.2离心管经121℃±2℃高压蒸汽灭菌15min。

5.2样品的采集和处理

5.2.1用拭子（4.2.11）采集猫眼周分泌物、鼻液、粪便，采集样品的拭子用少量PBS（4.3.1）浸

润后，3000r/min离心15min，取上清液待检。

5.2.2采集病死猫肠道、肝、脾等组织器官，加等体积PBS（4.3.1）研磨匀浆，3000r/min离心15

min，取上清液待检。

5.3DNA提取

按照基因组DNA提取试剂盒说明书要求操作，提取的基因组DNA应迅速进行荧光定量PCR扩增，

或置于-20℃冰箱（4.1.4）备用。

5.4反应体系

上游引物F(10μmol/L)

下游引物R(10μmol/L)

待检样品DNA

灭菌双蒸水

2

DB22/T2788—2017

表1（续）

试剂

剂量

SYBRPremixExTaqII(TliRNaseHPlus)（2×）

总体积

12.5μL

25.0μL

5.4.2以灭菌双蒸水为阴性对照，以猫泛白细胞减少症病毒基因组DNA或含目的片段的阳性质粒为阳

性对照。

5.5反应程序

实时荧光PCR反应程序见表2。

表2实时荧光PCR反应程序

温度

℃

时间

s

循环数

反应步骤

第一步

次

1

95

30

5

95

第二步

40

60

30

6结果判定

6.1结果分析条件设定

试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光

信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的

最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。

6.2.1阴性对照无Ct值并且无典型扩增曲线。

6.3.335.0＜Ct值≤40.0，出现特定的扩增曲线，样品判为疑似。应重新采样