DB22_T2922-2018_鸡传染性支气管炎病毒检测荧光RT-PCR法_吉林省.docxVIP

ICS11.220

DB22

B41

吉林省地方标准

DB22/T2922—2018

鸡传染性支气管炎病毒检测

荧光RT-PCR法

DetectionofchickeninfectiousbronchitisvirusReal-timePCRmethod

吉林省市场监督管理厅

发布

DB22/T2922—2018

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省动物疫病预防控制中心。

本标准主要起草人：呼延含蓉、程荣华、柴方红、张淑莹、王楠、于钦磊、高春生、吴丹、孙亮、

马晓媛、卢松岩、付瑶、王建超、陆伟、何浩、傅国群。

I

DB22/T2922—2018

鸡传染性支气管炎病毒检测荧光RT-PCR法

1范围

本标准规定了鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测方法的材料、操作步骤和结果判定。

本标准适用于鸡传染性支气管炎的诊断、监测及流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3材料

3.1仪器设备

3.1.1干热灭菌箱。

3.1.3冰箱，2℃～8℃，-20℃和-80℃三种。

3.1.4恒温水浴锅，控温范围为室温至100℃。

3.1.5可调移液器，最大量程为10μL，200μL，1000μL。

3.1.6高速冷冻离心机，12000r/min以上。

3.1.7荧光定量PCR扩增仪。

除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。

1

DB22/T2922—2018

3.3.5阳性对照，鸡传染性支气管炎病毒S1基因序列片段，见附录B。

3.4引物和探针

3.4.1引物和探针序列见表1。

表1引物和探针序列

名称

序列

上游引物F

下游引物R

探针P

5-ATCCTTTTATTAATAGTA-3

5-TAGTTTCTAGTCTAAAATTAC-3

5-CAAACACAAACAGCTCAGAGT-3

3.4.2引物和探针均用灭菌双蒸水稀释成10μmol/L，-20℃保存备用。

4操作步骤

4.1采样器具前处理

4.1.1组织匀浆器或研钵（3.2.5）、医用剪刀（3.2.2）、镊子（3.2.3）经160℃干热（3.1.1）

灭菌2h。

4.1.21.5mL离心管（3.2.4）经121℃±2℃高压蒸汽（3.1.2）灭菌15min。

4.2样品的采集、贮运和保存

4.2.1棉拭子样品的采集

将医用棉签（3.2.1）深入喉头上腭及上腭裂来回刮3次～5次，使其蘸有咽喉分泌液，然后将

咽喉拭子放入盛有1.0mLPBS（3.3.1）的离心管中，编号备用。

4.2.2组织样品的采集

样品采集后应置于加冰袋的保温箱中、密封，24h内送至实验室进行处理，超过24h应冷冻保

存。

4.3.2组织样品的处理

将组织样品按1:10比例加入PBS，用组织匀浆器或研钵研磨匀浆，3000r/min离心15min，取

上清液待检。

4.4RNA提取

2

DB22/T2922—2018

按照RNA提取试剂盒（3.3.2）说明书要求操作提取待检样品的RNA，提取的RNA应迅速进行荧光

定量RT-PCR扩增。若需长期保存应放置-80℃冰箱。

4.5反应体系

4.5.1荧光RT-PCR扩增反应体系见表2。

表2荧光RT-PCR反应体系

试剂

剂量

上游引物F(10μmol/L)

下游引物R(10μmol/L)

探针P(10μmol/L)

荧光RT-PCR反应液

灭菌双蒸水

0.8μL

0.8μL

0.5μL

10μL

5.9μL

2.0μL

20.0μL

待检样品RNA

总体积

4.5.2以灭菌双蒸水为阴性对照，以鸡传染性支气管炎病毒S1基因序列片段为阳性对照（3.3.5）。

4.6

反应程序

4.6.1荧光RT-PCR反应程序见表3。

表3荧光RT-PCR反应程序

试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光信

号达到设定的阈值时所经历的循