DB22_T3353-2022_猪δ冠状病毒检测重组酶聚合酶扩增(RPA)法_吉林省.docxVIP

ICS11.220

DB22

CCSB41

吉林省地方标准

DB22/T3353—2022

猪δ冠状病毒检测重组酶聚合酶扩增

（RPA）法

Recombinasepolymeraseamplificationmethodforthedetectionofporcine

deltacoronavirus

吉林省市场监督管理厅

发布

DB22/T3353—2022

前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本文件起草单位：吉林农业大学。

本文件主要起草人：王开、裴志花、胡桂学、孟凡茹、郭衍冰、邵洪泽、王海军、张德文、赵玉龙。

I

DB22/T3353—2022

猪δ冠状病毒检测重组酶聚合酶扩增(RPA)法

1范围

本文件规定了猪δ冠状病毒重组酶聚合酶扩增检测方法的原理、试剂和材料、仪器设备、生物安全、

样品、试验步骤和结果判定。

本文件适用于猪δ冠状病毒的实验室检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

下列术语和定义适用于本文件。

反转录重组酶聚合酶扩增reversetranscription-recombinasepolymeraseamplification

4缩略语

PBS磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSolution）

RT-RPA反转录重组酶聚合酶扩增（ReverseTranscription-recombinasePolymerase

Amplification）

RPA开始反应后，引物与重组酶组合形成复合物，在模板中寻找同源双链DNA进行定位，完成定

位后发生链交换反应，形成D-环状结构，使DNA结合蛋白与单链DNA链绑定。随后DNA聚合酶识别复

1

DB22/T3353—2022

合物中重组酶解离引物后暴露的3′端，进行片段扩增，形成两条新的双链DNA，如此循环，从而完成

对目的片段的扩增。反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。

6试剂和材料

6.1试剂

除另有说明，本方法仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。

6.1.1RPA扩增所用的引物序列见表1。

表1

引物序列

引物

序列（5′→3′）

片段大小

185bp

PDCoV-RPA-F

ATGTGCCTGGTGTTCAGGAGATGCTTTTCGCTGGC

AGTTGGTTTGGTGGGTGGCTCATAGGTCTGGTTA

PDCoV-RPA-R

6.1.2磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol/L，pH7.4）。

6.1.3动物组织RNA提取试剂盒。

6.1.4反转录试剂盒。

6.1.5重组酶聚合酶扩增试剂盒TwistAmpBasicRTKit。

6.1.6DEPC水。

6.1.750×TAEBuffer。

6.2材料

7.2台式低温高速离心机（4℃，12000r/min）。

2

DB22/T3353—2022

8.1样品采集、样品处理应按NY/T541的规定执行。

8.2实验室操作应按GB19489的规定执行。

9样品

9.1肠组织

9.1.1采集肠管组织样品不少于5g（7.1）。做好标识，置于密闭容器内，冷冻或4℃冷藏保存和

运输。

9.1.2

加入样品10%体积的PBS（6.1.2）研磨，过300目钢丝网（6.2.2），收集滤液，12000r/min

离心10min（7.2），取上清液待检。

9.1.3如不能立即检测，应保存于-20℃冰箱（7.6）。

9.2粪便

9.2.1使用无菌棉签（6.2.1,7.5），采集肛门粪便不少于5g，样品采集后冷冻或4℃冷藏保存和

运输。

9.2.2加入样品10%体积的PBS研磨，过300目钢丝网（6.2.2），收集滤液，12000r/min离心10min，

取上清液待检。

9.2.3如不能立即检测，应保存于-20℃