免疫学应用技术 实验五ELISA学习资料.doc

上海师范大学

实验报告

专业、年级08生物科学班级姓名________________学号_______________

课程名称免疫学实验名称酶联免疫吸附实验（ELISA）实验日期

目的

学习用酶联免疫吸附实验检测抗原（抗体）的方法。

原理

酶联免疫吸附实验是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证实验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种，即：用于检测抗体的间接法、用于检测抗原的双抗体夹心法，以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等的。比较常用的是双抗体夹心法和间接法。

试剂和器材

试剂

包被缓冲液（pH9.6、0.05M碳酸盐缓冲液）：

NaCO31.59g

NaHCO32.93g

加蒸馏水至1000毫升。

洗涤缓冲液(pH7.40.15MPBS)：

KH2PO40.2g

Na2HPO4*12H2O2.9g

NaCl8.0g

KCl0.2g

Tween-20(0.05%)0.5ml

加蒸馏水至1000毫升。

稀释液：

牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤缓冲液至100毫升。

或使用以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成的5%~10%液。

终止液（2MH2SO4）

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。

底物缓冲液（pH5.0磷酸柠檬酸）

0.2MNa2HPO4(28.4g/L)25.7ml,

0.1M柠檬酸（19.2g/L）24.3ml

加蒸馏水50ml.

TMB（四甲基联苯胺）使用液

TMB（10mg/5ml无水乙醇）0.5ml

底物缓冲液(pH5.5)10ml

0.75%H2O232微升。

ABTS（2，2‘-连氮基-双（3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸）显色液

ABTS0.5mg

底物缓冲液(pH5.5)1ml

3%H2O22微升

器材

聚苯乙烯塑料板（酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪、微量加样枪、塑料滴头、小毛巾、洗涤瓶

小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等

4℃冰箱，37℃孵育箱。

操作步骤

方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法

包被：用pH9.0、0.05M碳酸缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1mg/L~10mg/L.在每个聚苯乙烯板的孔中加0.1ml，4℃

加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤，同时做空白孔、阴性对照及阳性对照孔。

加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀度）0.1ml。置37℃孵育0.5~1小时，洗涤。

加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，置37℃孵育10~30分钟。

终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测A值：在ELISA读数仪上，于波长450nm（410nm）以空白对照孔调零后测各空OD值，若大雨规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二：用于检测未知抗体的间接法

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1mg/L~10mg/L.每孔0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤液洗三次。

加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤，同时做空白孔、阴性对照及阳性对照孔。

在反应孔中加入新鲜稀的酶标第二抗体（抗抗体0.1ml，置37℃孵30~60分钟，洗涤，最后一遍用洗涤液或蒸馏水洗涤。

其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

实验结果：