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作物青枯病菌LAMP检测技术规程及标准

1范围

本文件规定了作物（主要指芝麻、马铃薯、甘薯、花生、番茄、茄子、辣椒等）青枯病菌的LAMP检测技术。

本文件适用于作物（主要指芝麻、马铃薯、甘薯、花生、番茄、茄子、辣椒等）青枯病菌的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1LAMP扩增技术，环介导等温扩增技术（简称LAMP扩增技术）是一种可于特定恒温条件下，实现短时间内对靶标序列高效扩增的技术。检测结果通过肉眼观察绿色荧光的生成进行判断。该技术具有“简便、快速、精确、低价”的特点。已广泛用于病害的诊断及病原菌的定性定量检测。

4样品

4.1采集

将新鲜的疑似病株用吸水纸包好，整株带回实验室，保存于4℃冰箱备用。

4.2处理

截取适量待检测样品，剪碎后悬浮于装有适量无菌水的试管中，静置30min后，取悬浮液；或加适量无菌水研磨，静置5min，取上清液。以悬浮液或上清液为模板，以无菌水为空白对照，进行LAMP检测。

5LAMP扩增

5.1扩增模板

以提取的疑似作物病株样品组织悬浮液或上清液为模板，以模式菌株GMI1000菌悬液为阳性模板，以无菌水为阴性模板，采用特异性引物（附件A）对待测样品进行LAMP检测。

5.2扩增体系

扩增反应在25μL体系中进行，各组分如下：1μL样本悬浮液或上清液，1μLBstDNA聚合酶2.0（8000U/mL）,4μL5M甜菜碱,1μL12.5mMMnCl2，1μL0.6μM钙黄绿素，去离子水补足至25μL。

5.3扩增条件

扩增条件为:60℃扩增60min，80℃5min使酶热变性失活终止反应。

6结果判断

6.1肉眼观察

LAMP反应结束后，通过观察反应液颜色的变化进行判断。颜色变绿色为阳性结果，无颜色变化（仍为桔红色）为阴性结果。

6.2电泳检测

条件允许，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。取3μL反应产物，加入0.5μL6倍上样缓冲液（6×loadingbuffer）,混匀，在2%的琼脂糖凝胶上90V恒压电泳30min,凝胶成像仪扫描拍照进行判断。出现梯形条带为阳性结果，没有出现条带为阴性结果。