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#资讯#Nature子刊：精确检测CRISPR脱靶效应的新方法
通
CRISPR和TALENs作为新兴的组编辑技术，虽然优势多多，但是仍然被脱靶效应所
困扰。希望之城贝克曼和浙江大学第一附属医院的研究人员开发出一种新策略，
有望帮助人们检测这种意想不到的结果。这项成果于本周于《Nature
Biotechnology》上。
CRISPR和TALENs技术目前被广泛应用于研究中，而将来更有望用于临床，但脱靶效应
的存在始终是个问题。因此，需要有效的方法来确认切割是否在适当的位置。计算机算
法和体外选择都能够用来筛查潜在的脱靶位点，但它们往往不能准确预测。
为了开发出一种更好的方法来检测这两种技术的脱靶效应，希望之城的研究人员
Jiing-KuanYee及其同事使用了一种基于整合酶型慢载体（IDLV）的技术。这项
技术最初由德国的团队开发，来鉴定锌指酶（ZFN）的意外切割。
在非同源末端连接（NHEJ）的修复过程中，线性的双链IDLV组能够优先整合
到双链断裂（DSB）中。根据之前的文章，这些IDLV能够引入ZFN处理的细胞，标记
受到这种方法的启发，Jiing-KuanYee将其修改后应用于CRISPR和TALENs。“本质上
是同法，但我们利用一种不同的方法来产生双链断裂，”Yee谈道。
在他们的实验中，Yee及其同事产生了靶定两个的CRISPR/Cas9酶和TALENs。
这两个分别是Wiskott-Aldrich综合征（WAS）和酪氨酸氨基转移酶（TAT）。
它们突变时会引起疾病。
研究人员利用表达CRISPR/Cas9酶或TALENs的质粒转染HEK细胞，转导了
IDLV。这个IDLV携带的赋予了抗生素和嘌呤霉素的抗性酶形成DSB后，允许IDLV
整合，使得耐受嘌呤霉素的克隆数量增加了两到三倍。
对于CRISPR/Cas9和TALEN处理过的细胞，研究人员在目标切割位点的60bp内鉴定
出成簇的IDLV整合位点（CLIS）。当他们寻找WAS和TAT以外的CLIS时，在TALEN处
理的细胞中未找到脱靶位点，而在CRISPR/Cas9酶中发现一些。他们利用预测
和深度来确定IDLV分析的灵敏度，发现它能够检测频率低至1%的脱靶切割。
Yee认为，IDLV方法并非完美，因为它不能可靠检测低频率的脱靶位点，但强调这种方
法的无偏向性。“这是一个生物学分析；它并非基于哪些可能是脱靶位点的预测，”他补充
道。
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