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杨树叶枯病诊断技术规程

1范围

本文件规定了杨树叶枯病田间诊断及室内技术要求。本文件适用于辽宁省杨树叶枯病的室内及田间诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T15161林业资源分类与代码林木病害GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法LY/T3101林业有害生物代码

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

杨树叶枯病（poplarleafblight）

由链格孢菌（Alternariaalternata）引起的一种杨树叶部真菌病害。

3.2

链格孢菌（Alternariaalternata）

链格孢菌属真菌界子囊菌门（Ascomycota）、座囊菌纲（Dothideo-mycetes）、格孢腔菌目（Pleosporales）、

格孢腔菌科（Pleosporaceae），一种典型的腐生性病原真菌，其寄主广泛，可以引起瓜果采后腐烂病、花卉花枯病、中草药及林木等的叶斑病和叶枯病。

3.3

柯赫氏法则（KochsRule）

柯赫氏法则又称柯赫氏假设或柯赫氏证病律，是确定侵染性病害病原物的操作程序，主要包括共存性观察、分离、接种和再分离。

在病植物上常伴随有一种病原微生物存在，该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养，将纯培养接种到相同品种的健康植株上，引起症状相同的病害，从接种发病的植物上再度进行分离到其纯培养，性状与接种物相同。经上述步骤并得到确实的证明，就可以确认该生物即为该病害的病原物。

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4诊断准备

4.1仪器设备

超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、生化培养箱、冰箱、分析天平、电磁炉、不锈钢锅（2L~4L）。

4.2诊断用具

解剖剪、镊子、接种针、载玻片、盖玻片、酒精灯、培养皿、量杯（1L）、量筒（1L）、锥形瓶（150mL）、药匙、自封袋、记号笔、称量纸、酒精棉球、喷壶、封口膜。

4.3试剂

0.1%氯化汞（HgCl）、75%酒精、95%酒精、无菌水（GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法）。

4.4培养基

马铃薯蔗糖培养基（PDA）：配置方法详见附录A。

5杨树叶枯病害诊断

5.1诊断时间

7月上旬至9月中下旬。

5.2田间诊断

调查有疑似症状的叶片，依据出现典型症状的病状和病症，杨树叶枯病症状见附录B。

5.3病原物分离培养

5.3.1病害样本采集

采集疑似病害样品，对其症状特点描述记载，装入自封袋内，做好标记，带回实验室内于4℃冰箱内暂存。

5.3.2分离培养

采用常规组织分离法进行病原物分离。采集带有典型病斑的病叶，于超净工作台中首先用无菌水清洗病叶3遍，然后经75%酒精消毒2min，无菌水漂洗3次，再用0.1%HgCl消毒2min，无菌水漂洗3次，剪取病健交界处叶片组织约0.5cm×0.5cm接种至马铃薯蔗糖琼脂（PDA）固体平板培养基中，置于25℃生化培养箱中进行培养，待菌落直径达到2cm左右时，挑取菌落边缘菌丝进行转接、纯化，并于4℃冰箱保存备用。

5.4致病性测定

根据柯赫氏法则，以菌丝块作为接种材料进行致病性测定。4℃冰箱中保存的菌株接种于PDA平板培养基上，25℃培养7d，用直径为6mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼。选择健康的一年生杨树盆栽苗中上部叶片，叶片表面用75%酒精擦拭消毒后，将菌饼放置在主脉两侧叶片上，每侧放置一个菌饼菌丝面朝下，对照处理接种PDA培养基块，用蘸有无菌水的脱脂棉覆盖后用保鲜膜包好固定保湿，25℃条

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件下培养，观察叶

片发病情况。叶片发病后，从发病部位进行再次分离，叶片症状与B.1规定一致，获得病原物形态与B.2规定一致，确定分离物为致病菌。

5.5病原物镜检

5.5.1病害样本的镜检

选取疑似病害植物组织病健交界处组织，制作徒手切片并进行镜检，观察病原特征菌丝体和分生孢子特征。

5.5.2病原物纯培养镜检

采用玻片培养法对分离的菌种进行菌丝和孢子形态观察。将分离菌种平板用打孔器（直径6mm）打取菌饼，接种在培养皿中心位置，将无菌的盖玻片斜插到平板中约呈45°,待菌丝长到盖玻片中央时，用镊子轻轻将盖玻片抽出，盖玻片中有菌丝的一面朝上，用OLYMPUSBX51显微镜镜检，观察菌丝及孢子形态并拍照。

病菌形态描述见附录B。

5.6病原菌分子鉴定

4℃冰箱中保存的菌株接种于PDA平板培养基上，25℃培养