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GB/T14926.22—202X

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附录A

（规范性附录）

小鼠肝炎病毒核酸检测方法

A.1主要设备和材料

A.1.1实时荧光PCR仪。

A.1.2高速冷冻离心机。

A.1.3台式离心机。

A.1.4恒温孵育器。

A.1.5旋涡振荡器。

A.1.6组织匀浆器或手持式均质器。

A.1.7生物安全柜。

A.1.8PCR工作台。

A.1.9-80℃冰箱，-20℃冰箱，2~8℃冰箱。

A.1.10微量移液器（10μL，100μL，1000μL）。

A.1.11无RNase和DNase的离心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），无RNase和DNase

的吸头（10μL，200μL，1mL），无RNase和DNase的PCR扩增反应管。

A.2主要试剂

A.2.1商品化病毒核酸提取试剂盒或等效试剂。

A.2.2商品化逆转录试剂盒或等效试剂。

A.2.3实时荧光定量PCR试剂（探针法）盒或等效试剂盒。、

A.2.4引物和探针：根据表1序列合成引物和探针，引物和探针加无RNase去离子水分别配



制10mol/L储备液，-20℃保存。

A.3样本的采集和处理

A.3.1脏器组织

将活体动物安乐死后剖检，无菌采集小鼠肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏、肠，按照5倍比

例加入灭菌PBS，充分匀浆，离心取上清液转入另一无菌离心管中，编号备用。

A.3.2盲肠内容物或粪便

无菌采集小鼠盲肠内容物或粪便，按照5倍比例加入灭菌PBS，充分匀浆，离心取上清

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液转入另一无菌离心管中，编号备用。

A.3.3实验接种物

直接取待测细胞培养物、肿瘤组织等待测实验接种物于无菌离心管中，反复冻融3次，

细胞混悬液转移于15mL离心管中，12000r/min离心10min，去细胞碎片，上清液转移到无

菌15mL离心管中，编号备用。

A.3.4实验动物环境样本

取适量实验动物饲料和垫料置于无菌样品袋中；

取适量实验动物饮水直接转移到无菌离心管中；

用无菌拭子拭取实验动物笼具出风口初效滤膜表面粉尘装入无菌离心管中；

取笼具系统内置的出风口粉尘吸附介质装入无菌离心管中；

用无菌拭子拭取实验动物环境中的待测位置后装入无菌离心管中；

以上样本按照5倍比例加入灭菌PBS，充分匀浆，离心取上清液转入另一无菌离心管中，

编号备用。

A.3.5样本的运输和存放

样本采集后应密封、加冰并尽快运送到检测实验室。在2~8℃条件下暂存应不超过24h，

若不能立即检测应-20℃保存，若需长期保存，须置于-80℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融

不超过3次）。

A.4病毒核酸提取

选择商品化病毒RNA提取试剂盒，提取样本中的RNA。RNA的提取操作应在生物安全

柜中进行，避免气溶胶污染。制备好的RNA应尽快进行下一步逆转录反应，若暂时不能进

行逆转录反应，应于-80℃冰箱保存备用。

A.5逆转录（RT）反应

按试剂盒操作说明进行，不同试剂盒会有差异，在此仅举例说明。逆转录25L反应体



系：5XPrimeScriptRTMasterMix5L，待检RNA8L，RNaseFreeddHO补齐。反应条件：

2

37℃15min，95℃15sec，4℃5min，各一个循环，获得样本的cDNA，cDNA如果不立刻使

用，保存于-20℃。

A.6实时荧光RT-PCR

A.6.1实时荧光RT-PCR反应体系

实时荧光RT-PCR反应体系见表A1。反应液的配制在冰上操作，每次反应同时设计阳

性对照、阴性对照和空白对照，其中阳性对照以含有小鼠肝炎病毒的组织或细胞培养物获得