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PAGE胶电泳、转膜试验技术专辑

电泳

带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反电极移动，称为电泳(electrophoresis,EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不一样而达成分离技术称为电泳技术。1937年瑞典学者A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪，分离了马血清白蛋白3种球蛋白，创建了电泳技术。

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PAGE配胶试剂和配方百分比对电泳结果质量当然有决定性影响,配胶百分比，在《分子克隆》上有详细阐述。也可选择已经凝好预制胶，各种配方各种百分比各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，试验结果更漂亮，分辨率高，尤其是重复性好，条带完美。{拜力生物为您准备了全部电泳试剂，包含上样buffer，SDS配胶试剂盒，电泳buffer、蛋白Marker和蛋白染色试剂盒。第一步：依照目标蛋白分子量大小选择适宜凝胶浓度进行凝胶配制，能够使用SDS－PAGE凝胶配制试剂盒。第二步：进行蛋白变性，样品先置95℃水浴加热5分钟，接着置冰浴中5分钟，10000g离心20分钟，取上清液（样品可立刻使用也能够分装冻存，-20℃可稳定保持数月）。蛋白上样缓冲液能够使用5×SDS蛋白上样缓冲液。第三步依次加入预染蛋白分子量标准和待分析样品。）}

基本操作流程：

提取细胞或组织蛋白、测定大致含量

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制备SDS胶

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蛋白样品变性、电泳

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电泳转膜

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封闭（1小时）

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一抗(3小时左右或4度过夜)?

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TBST洗涤（洗三遍）

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HRP标识二抗（1小时）

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TBST洗涤（洗四遍）

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ECL试剂作用

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X-光片曝光、显影

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结果分析

详细操作流程?

1.试剂配制与订购

1.1.SDS蛋白上样缓冲液

1.2SDS凝胶配制

1MTris-HCl（pH6.8）:称取24.23gTris，加ddH2O充分溶解，用浓HCl调整pH值至6.8（约14ml），定容至200ml，121oC20min灭菌，室温保留。

1MTris-HCl（pH8.0）:称取24.23gTris，加ddH2O充分溶解，用浓HCl调整pH值至8.0（约8.4ml），定容至200ml，121℃20min灭菌，室温保留。

1.5MTris-HCl（pH8.8）:称取36.34gTris，加ddH2O充分溶解，用浓HCl调整pH值至8.8（约5ml），定容至200ml，121℃20min灭菌，室温保留。

10%（W/V）SDS:称取50gSDS，加400mlddH2O，68℃加热溶解。滴加浓HCl调整pH值至7.2，定容至500ml，室温保留。

30%（W/V）Acrylamide:称取29gAcrylamide，1gN，N’-至甲双丙烯酰胺（BIS），加ddH2O溶解，定容至100ml，用0.45m滤膜滤去杂质，4℃避光保留。

0.02MPH7.2PBS：称取Na2HPO4·12H2O5.8g，NaH2PO4·2H2O0.59g，NaCl8.5g，定溶至1000ml蒸馏水中。

10%（W/V）过硫酸铵:称取0.1g过硫酸铵，加1mlddH2O充分溶解，4℃保留（使用期约为两周）。

1.3SDS电泳液

5×Tris-GlycineBuffer（SDS电泳缓冲液）:称取15.1gTris，94gGlycine，5gSDS，加ddH2O充分溶解，定容至1L，室温保留。

1×Tris-GlycineBuffer（SDS电泳缓冲液）:量取200ml5×Tris-GlycineBuffer，定溶至1L，混匀，室温保留。

1.4NC膜（硝酸纤维素膜）PVDF膜

1.5Western转膜液

称取2.9gGlycine，5.8gTris，0.37gSDS，加ddH2O充分溶解，定容至800ml，加入200ml甲醇，混匀，室温保留。

1.6洗涤液

20×TBS:称取88gNaCl，加ddH2O充分溶解，加入100ml1MTris·HCl（pH8.0），定容至500ml，室温保留。

TBSTBuffer:量取50ml20×TBS，0.5mlTween20，加ddH2O定容至1L，混匀，室温保留。

1.7封闭液

称取5g脱脂奶粉，加入100mlTBSTBuffer中，充分溶解，4oC保留。

1.8一抗，二抗

1.9EasySeeWesternBlotKit

1.10marker

1.11BCA蛋白定量试剂盒

2.蛋白样品制备

2.1蛋白粗提

在人体中IgG占总抗体80%，成人血清中含量为12.5%/ml左右，IgG粗纯通惯用饱和(NH4)2SO4(SAS)进行，通常操作以下：

1）8ml血清中加入8mlPBS（0.02PH7.0），混匀后滴加4mlSAS