PCR的基本原理和应用课件.ppt

分子生物学技术1Polyacrylamide(聚丙稀酰胺):hashighresolvingcapability,andcanresolveDNA/RNAthatdifferfromeachotheraslittleasasinglebasepair/nucleotide.PCR的基本原理和应用分子生物学技术1聚合酶链式反应（PCRPolymeraseChainReaction）一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。分子生物学技术1PCR技术基本原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。分子生物学技术1分子生物学技术1分子生物学技术1RAPDSSRRFIPRT-PCRNested-PCRPCRmutagenesis(诱变)RaceGenomicwalking分子生物学技术1Reversetranscriptase(RT)-PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18primeranneal5‘-CapAAA(A)n3‘5‘ReversetranscriptiondNTP,RT5‘-CapAAA(A)n5‘cDNA:mRNAhybridRegularPCR分子生物学技术1NestedPCRFirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterest分子生物学技术1SP6primerT7primerForwardmutagenicprimerReversemutagenicprimerFirstPCRRemoveprimersDenatureandannealExtendtofulllengthbyDNApolymerase3’3’PCRmutagenesis(诱变)分子生物学技术1SecondPCRSP6primerT7primerDNAcloning分子生物学技术1克隆(clone)一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系。其动词含义指，即技术。

分子克隆(clone,cloned,cloning)

在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。

分子克隆分子生物学技术1Cloningvectors(克隆载体):在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。E.colicloningvector(circular): plasmids(质粒) bacteriophages(landM13)(噬菌体) plasmid-bacteriophagelhybrids(cosmids) (考斯质粒,质粒和噬菌体杂和体).Yeastcloningvector:yeastartificial chromosomes(YACs，酵母人工染色体) (Linear)分子生物学技术1分子生物学技术1限制性内切酶连接酶分子生物学技术1用相同的限制性内切酶对插入片段和载体同时酶切。用连接酶将插入和载体连接。将连接产物导入感受态细胞中。