DB34_T2515-2015_猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法_安徽省.docxVIP

ICS11.220

B41

DB34

安徽省地方标准

DB34/T2515—2015

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

RT-PCRassayforporcineepidemicdiarrheavirus

安徽省质量技术监督局发布

DB34/T2515—2015

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。

本标准由安徽省农业标准化委员会归口。

本标准由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所提出。

本标准起草单位：安徽省农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准起草人：潘孝成、张丹俊、赵瑞宏、沈学怀、周学利、胡晓苗、戴银、侯宏艳、李贺侠、张

宁、何国荣、周德权、王庆。

I

DB34/T2515—2015

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法

1

范围

本标准规定了猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）RT-PCR检测方法及

其技术要求。

本标准适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中PEDV核酸的检测。

2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction）

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）

DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

3原理

根据PEDV保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延

伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。

4仪器

1

DB34/T2515—2015

4.8水浴锅。

4.9微量移液器。

5试剂和材料

5.1RNA抽提试剂：Trizol。

5.2氯仿、异丙醇、乙醇。

5.3M-MLV反转录酶。

5.4RNA酶抑制剂。

5.5DEPC处理的灭菌水。

5.6TaqDNA聚合酶。

5.7dNTP。

5.8DL2000DNAMarker。

5.9RT-PCR反应试剂。

5.10溴化乙锭（EB，10μg/μL）或核酸染料。

5.11磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.2），见附录A中的A.1。

5.1250×TAE电泳缓冲液，见附录A中的A.2。

5.131％琼脂糖凝胶，见附录A中的A.3。

5.14引物：

——上游引物5’-GTGGTCGGAAGAGTAATAACATAC-3’，

——下游引物5’-CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC-3’，

——引物浓度10pmol/μL。

6操作步骤

6.1样品的采集及处理

15mL离心管、1.5mL离心管、剪刀、镊子和研钵，经121（±2）℃，15min高压灭菌并烘干。

采取病死或剖杀猪的小肠内容物，按1:5倍体积加入PBS，研磨冻融3次，装入15mL灭菌离

心管中，8000rpm离心10min，取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。

取发病猪新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1:5倍体积加入PBS，混匀，8000rpm离心10

min，取上清液转入1.5mL离心管中，-80℃保存备用。

6.2RNA提取

2

DB34/T2515—2015

6.2.1用Trizol提取待测样品、阳性对照和阴性对照样品的RNA。

200μL的样品和800μLTrizol置于一个1.5mL离心管，反复颠倒混匀，室温静置5min。

6.2.2

6.2.312000g4℃离心5min，吸取上清移入新的离心管中，加入200μL氯仿，用手剧烈振荡15s，

室温静置5min。

6.2.412000g4℃离心15min，吸取上层水相移入新的离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混

匀，室温静置10min。

6.2.512000g4℃离心10min，小心弃去上清，加入75％乙醇1mL（DEPC水配制）。

6.2.612000g4℃离心5min，弃去乙醇，室温干燥2～5min，加入适量DEPC水