DB13T 1080-2009 乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定.docxVIP

ICS67.100X16

DB13

河

北

省

地方标

准

DB13/T1080-2009

乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定

Detectionofβ-lactamasesinmilkandmilkproducts

2009-05-27发布2009-06-11实施

河北省质量技术监督局发布

I

DB13/T1080-2009

前言

本标准的附录A和附录C为规范性附录，附录B为资料性附录。本标准由河北省质量技术监督局提出并归口。

本标准第一法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第二法由河北省食品质量监督检验研究院起草。本标准第三法由河北省科学院生物所起草。

本标准第一法主要起草人：周正、周巍、李丛芬、穆燕魁、张岩。本标准第二法主要起草人：李挥、张敬轩、庞坤、范斌、张岩。

本标准第三法主要起草人：闫静辉、陈英珠、吴萌、程华、李春生、张小兵、董超、李亚璞。

1

DB13/T1080-2009

乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定

第一法杯碟法

1范围

本标准规定了乳及乳制品中β-内酰胺酶的检验方法-杯碟法。

本标准适用于生鲜乳、巴氏杀菌乳及灭菌乳中具有活性且对舒巴坦敏感的β-内酰胺酶的检验。本方法的检出限为4U/mL。

2原理

该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性，并以青霉素作为指示物，通过比对加入β-内酰胺酶抑制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑菌圈的大小来间接测定样品中的β-内酰胺酶。

3设备和材料

3.1抑菌圈测量仪或测量尺。

3.2恒温培养箱：36℃±1℃。

3.3高压灭菌器。

3.4无菌培养皿：内径90mm,具陶瓦盖。

3.5无菌牛津杯：外径(8.0±0.1)mm,内径(6.0±0.1)mm,高度(10.0±0.1)mm。

3.6麦氏比浊仪或标准比浊管。

3.7无菌吸管：1mL(0.01mL刻度值),10mL(0.1mL刻度值)。

3.8加样器：5μL~20μL,20μL～200μL及配套吸头。

4培养基和试剂

除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的三级水。

4.1试验菌种：藤黄微球菌(Micrococcusluteus,CMCC(B)28001),使用菌株代数3-14代。

4.2磷酸盐缓冲溶液：按附录A中A.1规定。

4.3生理盐水(8.5g/L):按附录A中A.2规定。

4.4青霉素标准溶液：按附录A中A.3规定。

4.5β-内酰胺酶标准溶液：按附录A中A.4规定。

4.6舒巴坦标准溶液按附录A中A.5规定。

4.7营养琼脂培养基：按附录A中A.6规定。

4.8抗生素检测用培养基Ⅱ:按附录A中A.7规定。

4.9空白牛奶：按附录A中A.8规定

5操作步骤

5.1菌悬液的制备

将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经36±1℃培养18h～22h,用无菌生理盐水洗下菌苔即为

2

DB13/T1080—2009

菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1×101CFU/mL,4℃保存，贮存期限2周。

5.2样品的制备

将待检样品充分混匀，取1mL待检样品于1.5mL离心管中共4管，分别标为：A、B、C、D,每个样品做三个平行。

5.3对照的制备

5.3.1阴性对照，每次检验应取空白牛奶1mL加入到1.5mL离心管中共四管，分别标为：A、B、C、D,每次实验均做三个平行作为对照。

5.3.2阳性对照，取空白牛奶1mL加入到1.5mL离心管中，加入β-内酰胺酶标准溶液25μL,共做四管，分别标为A、B、C、D,每次实验均做三个平行作为对照。

5.4检验用平板的制备

取90mm灭菌培养皿，底层加10mL灭菌的抗生素检测用培养基Ⅱ,凝固后上层加入5mL含有浓度为1×108CFU/mL藤黄微球菌的抗生素检测用培养基Ⅱ,每个检验用平板上均匀放置4个无菌牛津杯。

5.5样品的测定

按照下列顺序分别将青霉素标准溶液、β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加入到5.2各离心管中：

A青霉素5μL。

B舒巴坦25μL、青霉素5μL。

Cβ-内酰胺酶25μL(终浓度4U/mL)、青霉素5μL。

Dβ-内酰胺酶25μL(终浓度4U/mL)、舒巴坦25μL、青