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#分析流程#3P-seq技术及数据分析
薇安
简介
3P-seq是Janet.al.于2010年开发的用于检测不同3UTR情况的高
通量方法。它能够检测出转录本3UTR的末端位置，获得的
不同3UTR模式。这种方法与之前检测方法相比精度更高，而且可
以避免“poly(A)”方法的局限性。（Formation,RegulationandEvolution
ofCaenorhabditiselegans3′UTRs.Nature.2011）
实验流程
1、大致流程图如下:
步骤1：首先，将一种配体（splint-ligation）与带有生物素引物绑定
位点（biotinylatedprimer-bindingsite）的poly(A)结合。这样就能筛选
得到带有poly(A)尾的mRNA
步骤2：通过T1核酶部分（whichcutsafterGs）。该步能将
mRNA的非3’端降解掉
步骤3：洗脱并捕捉poly(A)
步骤4：将获得的poly(A)通过dTTP这一脱氧核苷三磷酸进行逆转
录。这一步是为了合成双链结构，为下一步酶解提供条件
步骤5：通过RNaseH并释放poly(A)
步骤6：提取上层清液并进行纯化
步骤7：对提取得到的片段两端加adaptor，应用到高通量中去。
2、Protocol介绍的流程
Step1:Enrichforpoly(A)RNA
利用oligo(dT)提取带poly(A)的RNA
Step2:Biotinattachmenttopolyadenylate3´ends
在poly(A)RNA的末端加上Biotin
Step3:RNaseT1Digestion
利用RNaseT1将3UTR之前的序列分解掉
Step4:Biotincaptureand3´endtagrelease
对捕捉到Biotin的RNA进行逆转录，再通过RNaseH分解将3端释
放
Step5a:Librarypreparation–3´ligation
加上3adaptor
Step5b:Librarypreparation–phosphorylate5´ends
将5端磷酸化
Step5c:Librarypreparation–5´ligation
加上5adaptor
Step5d:Librarypreparation–RT-PCR
通过RT-PCR进行扩增
Step6:Librarysequencingandanalysisconsiderations
通过二代平台检列信息
结果分析
原文中通过该技术对线虫的转录组进行检测，识别不同的3’UTR可
变位点。
1、比对read并寻找3P-Seqtag
对于3P-Seq的结果，首先将read的逆向互补作为候选的
3Ptags，这些候选tag通过Bowtie映射到线虫组上（WS190）。
这里需要注意的是，由于3P-Seq产生的read末端会含有至少两个A
碱此比对时必须要考虑read尾部的错配问题。这里作者设置参
数为-q--solexa-quals-5–3-l25-n1-e240-m1，该参数设定允许3’端
非模版核苷酸（untemplatednucleotides）的出现。将检测到的read比
对到组或转录组后，只考虑末端有两个或两个以上A的read，并
且至少有一个A不在组模板链上。这样，映射到同一组位置
的read作为3P-Seqtags。这里Protocol中
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