重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建.pptx

重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建;基因、载体、受体菌株;实验技术要求;实验流程:第一天8AM-5PM;实验流程:第二天8AM-5PM;实验流程:第三天1PM-5PM;实验流程:第四天8AM-5PM;rhIL-18的PCR;双酶切反应（20μL体系）;Hybridsite;培养基配制;灭菌;琼脂糖电泳;琼脂糖凝胶的配制;琼脂糖凝胶回收;1.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。

2.将切好的胶块样品直接转入离心管中，加入400μl吸附液U，55℃温浴10min,期间颠倒离心管混匀3次，使胶块彻底融化。

3.加入磁珠10μl，颠倒振荡混匀，室温吸附10min,期间振荡混匀2-3次。

（磁珠使用前需要充分漩涡震荡混匀后立刻吸取，但震荡不超过30s，可多次短时振荡）

;4.将离心管置于磁力架上，磁吸至上清澄清，彻底吸弃所有液体。

5.加入200μl洗涤液GW，充分颠倒振荡混匀。

6.将离心管置于磁力架上，磁吸至上清澄清，彻底吸弃所有液体。

7.加入200μl80%乙醇，充分颠倒振荡混匀。

8.将离心管置于磁力架上，磁吸至上清澄清，彻底吸弃所有液体。

;9.保持离心管在磁力架上，开盖，室温干燥5-10min，至磁珠表面无光泽。

10.再次吸弃离线管中的残留液体

11.加入20-50μl洗脱液XE或无菌水，用微量移液器混匀后室温放置5min，期间振荡混匀1次。

此步不能放到磁力架上

12.将离心管置于磁力架上，磁吸至上清澄清，取出纯化后的DNA溶液。

;平板铺制;连接反应;酶切产物比例换算;感受态菌的制备;pUC18-hIL-18重组质粒的转化;（2）将该EP管放入预加温至42℃的水浴中，放置90s，快速转移到冰浴中，使细胞冷却1~2min。

（3）向EP管加入800μLLB培养基，转移至37℃摇床上，180r/min，温育45min以复苏菌株。

（4）将200μL上述培养物加到含100μg/mL氨卞青霉素的LB平板上，以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面。

（5）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，37℃过夜培养；

;感受态细胞转化效率的计算;柱式质粒小量抽提;5.12,000×g离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

注意：P3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

6.将上一步收??的上清液用移液器转移到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），尽量不要吸出沉淀。8000×g离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

7.向吸附柱中加入500μl漂洗液WashSolution，9000×g离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

8.重复步骤7。;9.将吸附柱放入收集管中，空吸附柱9000×g离心1min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。

注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。建议将吸附柱CP3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10.将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl水，室温放置1min，12,000rpm离心1min，将质粒溶液收集到离心管中。;PCR鉴定阳性克隆原理;PCR鉴定;3．PCR反应循环条件设置

94℃变性反应30s；

45℃退火反应30s；

72℃延伸反应30s。

进行30个循环后，最后一个循环72℃延长至10min。

4、检测

加2μL6×LoadingBuffer和10μL反应产物，混匀，取12μL反应产物点样电泳。

5、成像分析

在1%的琼脂糖凝胶上点样电泳0.5~1h，电泳结束后EB染色15～20min，凝胶成像分析结果。;分子生物学设计创新实验选题范围