基因芯片的制作方法.pptVIP

2.高密度的点阵技术1平方厘米的面积至少可排列上百万个探针合成区（“点”)第31页，共41页，星期日，2025年，2月5日3.Affymetrix独特的PM-MM探针设计第32页，共41页，星期日，2025年，2月5日图3-11PM-MM探针设计方案第33页，共41页，星期日，2025年，2月5日第34页，共41页，星期日，2025年，2月5日高灵敏度图3-12仅用PM探针与联合应用PM-MM探针检测靶序列的灵敏度比较第35页，共41页，星期日，2025年，2月5日芯片结果准确可靠图3-13PM-MM的多个探针的结果与单个探针的结果比较第36页，共41页，星期日，2025年，2月5日第37页，共41页，星期日，2025年，2月5日第38页，共41页，星期日，2025年，2月5日第39页，共41页，星期日，2025年，2月5日关于基因芯片的制作方法第1页，共41页，星期日，2025年，2月5日3.1概述1.基因芯片是以Southern印迹杂交技术为基础发展起来的。反向杂交技术第2页，共41页，星期日，2025年，2月5日2.基因芯片的制作方法：原位合成法：Affymetrix公司直接点样法（合成后点样）：Stanford大学，1995年第3页，共41页，星期日，2025年，2月5日项目原位合成法直接点样法探针预备不需要需要探针类型寡核苷酸寡核苷酸，cDNA，基因组DNA，蛋白等探针长度约25nt不限制联合合成需要不需要芯片表面点样不需要需要密度高低制作成本高低应用基因表达，突变检测基因表达，突变检测，CGH第4页，共41页，星期日，2025年，2月5日1.常见的载体类型膜玻片三维基质包被玻片3.2芯片载体的制作第5页，共41页，星期日，2025年，2月5日（1）膜优点：与核酸亲和力强。缺点：单位面积上点样密度低；背景较高；灵敏度低。第6页，共41页，星期日，2025年，2月5日（2）玻片优点：耐受高温和高离子强度；具有不浸润性，提高点样密度；背景低。缺点：二维的平面结构，与DNA杂交时会有空间位阻。第7页，共41页，星期日，2025年，2月5日（3）三维基质包被玻片具有三维孔性结构，更适合做蛋白质芯片的支持物，可以保持蛋白质的空间构象，不影响它的活性。第8页，共41页，星期日，2025年，2月5日2.玻片的修饰类型氨基修饰玻片同型双功能偶联剂修饰的玻片硫醇基修饰的玻片环氧硅烷化修饰的玻片等第9页，共41页，星期日，2025年，2月5日图3-3APS修饰玻璃表面反应示意（1）氨基修饰的玻片羟基氨基第10页，共41页，星期日，2025年，2月5日对苯乙异硫氰酸（2）同型双功能偶联剂包被修饰的玻片异硫氰基第11页，共41页，星期日，2025年，2月5日醛基戊二醛第12页，共41页，星期日，2025年，2月5日连接分子手臂分子特异性探针第13页，共41页，星期日，2025年，2月5日图3-7SMPB连接硫醇基核苷酸和氨基玻片（3）连接硫醇基修饰的玻片硫醇基第14页，共41页，星期日，2025年，2月5日图3-8环氧硅烷化玻片修饰示意（4）环氧硅烷化修饰的玻片环氧硅烷基第15页，共41页，星期日，2025年，2月5日1.cDNA探针2.寡核苷酸探针3.基因组DNA探针（很少用）4.RNA探针3.3探针的制备第16页，共41页，星期日，2025年，2月5日cDNA探针：主要来自cDNA文库，从细胞或组织中提取RNA后逆转。第17页，共41页，星期日，2025年，2月5日寡核苷酸探针：根据数据库中的基因序列人工合成的。通常在5’末端进行氨基修饰，并加入一段不直接参与杂交的重复序列，称为手臂分子，通常用polydT(10)。手臂分子特异性探针第18页，共41页，星期日，2025年，2月5日探针分子与基片表面的作用方式化学偶联：探针分子与基片表面活性基团发生化学反应，生成新的共价键。物理吸附：探针分子与基片表面通过次级键相连接。第19页，共41页，星期日，2025年，2月5日3.4点样仪及