免疫实验结果分析.ppt

关于免疫实验结果分析第1页，共40页，星期日，2025年，2月5日第一节免疫组化结果的判断原则?免疫组化结果的判断原则概括起来有以下几点：第2页，共40页，星期日，2025年，2月5日?⒈必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。⒉抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内；EMA应定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。第3页，共40页，星期日，2025年，2月5日?⒊阴性结果不能视为抗原不表达。由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。第4页，共40页，星期日，2025年，2月5日?⒋尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。第5页，共40页，星期日，2025年，2月5日?⒌对免疫组化标记结果的意义不能绝对化，应结合临床资料、X线等影像学及实验结果综合分析。第6页，共40页，星期日，2025年，2月5日*第二节对照染色设计第7页，共40页，星期日，2025年，2月5日(一）对照染色的目的设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三：①组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；②抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；③染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的pH和离子强度不当等。第8页，共40页，星期日，2025年，2月5日假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：①自发荧光或内源酶等干扰；②抗体试剂不纯(特别是一抗）；③操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；④Fc受体的干扰，等等。第9页，共40页，星期日，2025年，2月5日（二）对照的种类及其选用目的对照染色大致可分为：阳性组织对照、阴性组织对照及阴性试剂对照和自身对照四大类：第10页，共40页，星期日，2025年，2月5日⒈阳性组织对照指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。第11页，共40页，星期日，2025年，2月5日⒉阴性组织对照指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的是除外假阳性。第12页，共40页，星期日，2025年，2月5日⒊阴性试剂对照是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，包括有：空白对照；替代对照；吸收试验和抑制试验等。目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。第13页，共40页，星期日，2025年，2月5日⑴空白对照指以缓冲液（PBS、TBS等）取代第一抗体（主要的，必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代），其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。第14页，共40页，星期日，2025年，2月5日⑵取代对照指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体(靶生物缺如的)取代第一抗体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。⑶吸收试验是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳性着色明显减弱（吸收不全时）。第15页，共40页，星期日，2025年，2月5日⑷抑制试验是指用标记抗体和未标记抗体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗体）两者的混合物作试剂，其他步骤不变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳性着色应成比例的减弱（等量或1：9）。此试剂对照多用于直接法。第16页，共40页，星期日，2025年，2月5日这类阴性试剂对照的选用原则是：①空白对照不能省，其他对照在预实验中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂；②对照必需与实验片同步进行染色；③对照的结果应附合要求。第17页，共40页，星期日，2025年，2月5日⒋自身对照是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。第18页，共40页，星期日，2025年，2月5日*第三节非特异染色第19页，共40页，