如何解析蛋白质的空间结构.pptVIP

（五）超速离心ultracentrifugation*既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。第31页，共45页，星期日，2025年，2月5日蛋白质纯化方法总结：根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白质的方法：①分子大小；②溶解度；③电荷；④吸附性质；⑤对配体分子的生物学亲和力等。透析离心沉淀电泳层析第32页，共45页，星期日，2025年，2月5日关于如何解析蛋白质的空间结构第1页，共45页，星期日，2025年，2月5日研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。问题的提出：第2页，共45页，星期日，2025年，2月5日（一）蛋白质的两性电离一、理化性质蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)§6蛋白质的性质及其分离纯化第3页，共45页，星期日，2025年，2月5日当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点第4页，共45页，星期日，2025年，2月5日（二）蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可达100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷(电荷层）水化膜第5页，共45页，星期日，2025年，2月5日+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉第6页，共45页，星期日，2025年，2月5日（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。第7页，共45页，星期日，2025年，2月5日造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。变性的本质——破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。第8页，共45页，星期日，2025年，2月5日应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。第9页，共45页，星期日，2025年，2月5日变性蛋白质的性质改变：①物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；②化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。③生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。变性蛋白质的复性：第10页，共45页，星期日，2025年，2月5日天然状态，有催化活性尿素、β-巯基乙醇去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性第11页，共45页，星期日，2025年，2月5日*蛋白质沉淀在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。第12页，共45页，星期日，2025年，2月5日（四）蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。第13页，共45页，星期日，2025年，2月5日（五）蛋白质的呈色反应⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。第14页，共45页，星期日，2025年，2月