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犬细小病毒和犬冠状病毒双重RT-PCR检测方法
1范围
本文件规定犬细小病毒病和犬冠状病毒的双重RT-PCR的检测方法、试剂、设备和操作步骤。
本文件适用于犬、猫等犬细小病毒和犬、貉、狐狸等犬科动物等犬冠状病毒的检测，也适用于其他
易感动物的犬细小病毒和犬冠状病毒核酸检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
文件。
GB19489实验室生物安全通用要求
NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CPV：犬细小病毒（CanineParvovirus）
CCV：犬冠状病毒（CanineCoronavirus）
RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction）
RNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）
DEPC:焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）
5试剂和耗材
5.1病毒RNA提取试剂
可使用Trizol试剂手工提取病毒RNA，也可选取商品化的病毒RNA提取试剂盒或自动核酸提取设备
并参照说明书进行RNA提取。
5.2灭菌DEPC水
向1L超纯水中加1mlDEPC（使终浓度为1‰），静置4h以上，121℃高压30min，冷却以后，在
超净台内及时打开瓶盖，过夜挥发，备用。
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5.3其他试剂
试验所需的其他试剂的配制见附录A。
5.4引物和探针
5.4.1采用针对CPV和CCV的引物
扩增CPV引物P1和P2，可扩增片段337bp，扩增CCV引物C1和C2，可扩增片段852bp。具体序列见
附录B。
5.4.2采用其他引物
使用国家农业行政主管部门或海关总署批准的其他引物和探针，应对检测程序和判定标准做相应调
整。
5.5阳性对照和阴性对照
含CPV和CCV的犬肾传代细胞（MDCK）细胞毒、CPV和CCV的疫苗株、CPV和CCV的DNA片
段的重组质粒或其他商业化的CPV和CCV的阳性质控品均可作为阳性对照。正常未接毒的犬肾传代细胞
或正常犬组织或细胞可作为阴性对照。
6仪器与耗材
6.1生物安全柜。
6.2梯度PCR仪。
6.3高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上。
6.4组织研磨器或组织匀浆机。
6.5漩涡震荡器。
6.6冰箱，2℃~8℃和﹣20℃。
6.7超低温冰箱：可控温至-70℃。
6.8微量移液器：0.2μL~2μL，1μL~10μL，10μL~100μL，20μL~200μL，100μL~1000μL，并
配备与移液器匹配的吸头。
6.9高压灭菌锅。
7操作步骤
7.1样品采集及运输
样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集易感动物组织、细胞培养物或粪便等样本用于检
测，样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实
施现场消毒和废弃物处置。
7.2病毒RNA的提取
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7.2.1病毒核酸抽提使用Trizol手工提取，也可以使用等效的商品化病毒核酸提取试剂盒提取，在核
酸提取区操作。
7.2.2取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数、阳性对照数和阴性对照数之和，对
每个离心管进行
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