纸片法抗菌药物敏感实验操作标准.docVIP

纸片法抗菌药品敏感试验操作标准

4.3标准比浊管

用硫酸钡比浊管（0.5麦氏比浊标准）,标定接种菌液浓度。比浊管制备方法以下:（1）0.048mol/LBaCl2,（1.175%w/vBaCl2·2H2O）0.5ml,加到99.5ml0.18mol/L（0.36N）H2SO4（1％v/v）溶液中,制成比浊管;（2）用光径为1cm分光光度计测定光吸收来标定比浊管。0.5麦氏标准比浊管在625nm波长吸收光度应为0.08-0.1;（3）选管径与制备菌液试管相同螺口试管,每管分装4－6ml;（4）将试管帽拧紧,放室温暗处保留;（5）用前,将比浊管在旋转振荡器上混匀。如出现大颗粒,应更换;（6）每个月更换比浊管或复检比浊管浊度。

5操作步骤

5.1制备接种菌液

5.1.1增菌法步骤以下:（1）选琼脂平板上形态相同菌落最少4－5个,用接种环挑其顶部,移至4－5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中;（2）置35℃培养至菌液浓度达成或超出比浊管浓度（通常需2－6小时）,浓度约1－2×108CFU/ml;（3）用生理盐水或肉汤校正菌液浓度,与比浊管相同。可用光电比浊。目测比浊须在合适光照下以黑色线条为反衬。

5.1.2直接菌悬液法步骤以下:（1）做常规药敏试验,可直接用过夜培养菌落（必需用无选择性培养基平板,如一般琼脂培养基）在盐水或肉汤中制备接种菌液。菌液浓度调至0.5麦氏管;(2)此法适适用于在肉汤培养基中生长不好细菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和链球菌及葡萄球菌甲氧苯青霉素或苯唑青霉素耐药试验;（3）当用此法做复方磺胺药试验时,从平板上直接挑菌落时会携带相当量拮抗剂,造成敏感菌株抑菌环内出现轻微生长菌膜。

5.2接种平板步骤以下:（1）校正菌液须在15分钟内使用。用一无菌棉试子蘸取菌液并在上端管壁旋转挤压几次,去掉过多菌液;（2）用试子涂布整个琼脂平板表面,反复涂布几次,每次将平皿旋转60度,确保涂布均匀。（3）将平皿盖打开3－5分钟,使培养基表面水份吸收掉。然后贴药敏纸片;（4）注意:避免用过浓菌液,禁用未经稀释菌或其她不标准菌液接种平板。

5.3贴纸片（1）接种平板后,贴上药敏纸片。用镊子或针尖压一下纸片使其与培养基表面贴牢。纸片要贴得均匀,纸片与纸片中心距离不得小于24mm。标准上,直径150mm得平板贴12张纸片,直径100mm平板贴5张纸片。纸片贴后不应再移动,因为有些药品会立刻扩散;（2）贴上纸片15分钟内,须把平板倒放在35℃恒温箱中。因为抑菌环解释标准是在一般环境中标定,所以除嗜血杆菌和淋病奈瑟氏菌外,平板不可放在高CO2环境中。CO2与一些原因作用可使抑菌环增大。

5.4读取结果（1）经16－18小时培养后,观察结果。菌液浓度适合且涂得好,抑菌环规则,细菌呈融合生长。假如出现单个菌落,说明接种量小,需重做试验,测量抑菌环直径须包含纸片直径:手持平皿从后面目测检验每块平板,借反射光（黑色无放光背景）,用卡尺、一般尺或特制模板量取抑菌环直径,单位为毫米。培养基中假如加了血液,须打开平皿盖,借反射光,从正面量抑菌环。假如是葡萄球菌或肠球菌,须培养二十四小时后,经投射光检验苯唑青霉素和万古霉素抑菌环内有没有耐药菌株生长。抑菌环内有任何生长表现都表明是耐药菌株。（2）肉眼见不到细菌显著生长区域为抑菌环边缘,有极难识别细小菌落不算。如抑菌环内有大量细菌生长,须再移植出来,重新判定,重新做药敏试验。变形菌在一些抗菌药品纸片周围可弥漫生长到抑菌区域内,当抑菌环边缘清楚,弥漫生长不算。甲氧苄氨嘧啶和磺胺药拮抗剂会支持细菌生长,所以测这类药时可忽略轻微生长（80％以上受抑制）,以浓密生长区域作为抑菌环界限。用加血培养基测链球菌,测量抑菌环时不包含溶血环。（3）参考表2标准对抑菌环大小作出解释,以敏感、中介或耐药形式解释结果。

6娇嫩细菌

Mueller-Hinton培养基只适适用于快速生长细菌,通常不适于测定娇嫩细菌。娇嫩细菌药敏试验假如要用纸片法做,培养基、质量控制方法、解释标准都须做修改以适合每种细菌。以下介绍纸片方法用于流感嗜血杆菌,淋病奈瑟氏菌和肺炎链球菌等娇嫩细菌,结果是正确。其她细菌须用稀释法测定。厌氧菌不能用纸片扩散法测定抗菌药品敏感性。

结果解释

8.1抑菌环解释标准抑菌环解释标准见表2、2A、2B和2C。表中所列敏感类别首先是经过将抑菌环直径与肉汤或平板稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）进行比较,而且依据已知敏感和抗菌株抑菌环或MIC群体分布得出。然后再结合MIC与抑菌环直径相关分布,结合药