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几种中草药对于禽流感疾病的防治作用的研究

谭巧燕陈晓霞

指导老师：王林川教授

摘要：禽流感又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，被国际兽疫局定为甲类传染病，特别是高致病性禽流感最为严重，对于该病的防制具有重要的生物安全意义。本文通过运用鸡胚法对金银花等五种中药及复方制剂进行抗禽流感病毒的筛选试验，目的在于针对H9亚型禽流感病毒，研究出一种高效、低残留、使用方便的中药制剂。结果显示：北板蓝根、金银花、贯叶连翘、贯众、双黄连对鸡源H9亚型禽流感病毒株有良好的抑制作用。

关键词：禽流感中草药防治鸡胚

前言：禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的传染性疾病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，被国际兽疫局定为甲类传染病。高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率均高，感染的鸡群常常“全军覆没”。A型流感病毒也见于人、马、猪，偶可见于水貂、海豹和鲸等其他哺乳动物及多种禽类。人可经过呼吸道吸入病禽咳嗽和鸣叫时喷射出带有H5N1病毒的飞沫被感染。或进食病禽的肉及其制品、禽蛋，病禽污染的水、食物，用病禽污染的食具、饮具，或用被污染的手拿东西吃，受到传染而发病，也可以经过损伤的皮肤和眼结膜容易感染H5N1病毒而发病。随着我国改革开放政策的继续深入和发展，和世界的交往日渐增多，范围不断扩大，同时国内市场流通更为频繁。因此，如何预防禽流感的发生成为一个值得十分重视的问题。本实验从中医的角度，选用金银花、贯叶连翘、双黄连、贯众、北板蓝根几种中草药，进行鸡胚实验，旨在针对禽流感病毒，研究出一种高效、低残留、使用方便的中药制剂。对我国未来畜牧业，特别是养禽业的发展，具有重要的研究价值和社会意义；也为人民的生命健康提供重要的保证。

1材料方法

1.1材料

1.1.1试验用病毒

AIV病毒株：A/Chicken/Guangdong/1/2004（H5N?）（简称鸡源H5AIV）；

A/Duck/Guangdong/2/2004（H5N?）（简称鸭源H5AIV）；

A/Goose/Guangdong/3/2004（H5N?）（简称鹅源H5AIV）；

A/Chicken/Guangdong/3/2004（H9N?）（简称鸡源H9AIV）

均由本实验室分离、纯化保存。

1.1.2试验用药物抗禽流感病毒中药（最终的药物浓度均为1000mg/mL），部分由华南农业大学兽医学院药理研究室（陈建新副研究）提供，部分自行水煎提取。

1.1.3试验用鸡胚为10天龄低免疫鸡胚，由佛山市墟岗黄畜牧提供；

1.1.4HA试验用红细胞

1.1.5试验用酸碱0.1NNaOH，0.1NHCl。

1.2方法

1.2.10.5%的鸡红细胞的制备

由成年公鸡的翅静脉或心脏采血，放入灭菌试管（按每毫升血加入3.8％灭菌柠檬酸钠0.2mL做抗凝剂）内，迅速混匀。然后将血液注入离心管中，经3000转/分钟，离心10～15min，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加稀释液（生理盐水）洗涤，再用离心机3000转/min离心10～15min弃去上清液，再加稀释液洗涤，如此反复洗涤三次，将最后一次离心后的的红细胞泥，按0.5％的稀释度加入稀释液（0.5mL红细胞加99.5mL生理盐水）。

1.2.2禽流感病毒鸡胚半数感染量（EID50）的测定

将病毒原液用灭菌生理盐水按103~1010稀释，接种10天龄鸡胚，每个稀释度接种8枚胚（鸡源H5AIV采用了每个稀释度7枚胚的方法），0.2mL/胚，37℃孵育，24小时内死亡的鸡胚弃去。测定24小时后死亡胚的HA效价，大于4孔为阳性。按ReedMuench两氏法计算EID50

1.2.3药物pH值的调整

用0.1NNaOH，0.1NHCl将抗禽流感病毒中药的pH值调为6～8之间。

1.2.4药物对鸡胚的半数中毒剂量的测定

倍比稀释药物，设5个度，5胚/组，0.2mL/胚，96小时，另设空白对照组。对胚不致死、不影响胚体正常发育者判为安全。按ReedMuench两氏法计算半数中毒剂量，如用药物原液组胚体均正常发育，可视原液浓度为半数中毒剂量。

1.2.5药物对禽流感病毒的抑制作用

接种50个EID50（0.2mL）的病毒＋最大安全剂量的药物（0.2mL），5枚/组；37℃，72小时，24小时内死亡的胚弃去。72h冻胚（24h后死亡的胚则立即冻胚）

1.2.6统计方法

将对鸡、鸭、鹅源H5H5AIV和鸡源H9AIV均有完全抑制作用的中草药挑选出来，用鸡源H5AIV作为代表毒株，测定中草药对禽流感病毒的治疗指数（TI）。

采用寇氏法计算药物半数有效量ED50、治疗指数TI=半数中毒剂量/半数有效剂量[1]、Fisher精确概率检验法[2