《DNA重组技术的基本工具》讲稿.pptxVIP

一、基因工程的概念：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。原理操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因重组生物体外基因/DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达人类需要的基因产物

21限制酶的作用是能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开DNA连接酶的作用是连接被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键1.限制酶和DNA连接酶的作用分别是什么?问题探讨：

问题探讨：普通棉花抗虫棉苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。

想一想需要做哪些关键工作？

为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有?提示：从噬菌体侵染细菌中获得灵感

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在长期的进化过程中形成了完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制性核酸内切酶就是细菌的防御性工具，当外源DNA侵入时，限制性核酸内切酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制性核酸内切酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而保护自身的作用。

01A02A03T04T05G06C07C08T09T10A11A12G13磷酸二酯键14磷酸二酯键

如何切割DNA分子呢？DNA分子磷酸二酯键切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”

限制性核酸内切酶——“分子手术刀”（流感嗜血杆菌）来源——主要是从原核生物中分离纯化而来功能——一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。

限制酶的识别序列：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的

GobackEcoRⅠ黏性末端黏性末端

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重复演示

什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。

SmaⅠ平末端平末端

思考?01要想获得目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。01要把目的基因插入运载体的前提是什么必须用同一种限制酶来切割目的基因和运载体。01

模型构建1CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG练习使用EcoRI剪切目的基因CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG目的基因黏性末端

二、“分子缝合针”——DNA连接酶①作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.②作用原理：催化磷酸二酯键形成

可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶

模型构建2使用DNA连接酶制作重组DNA分子甲片段CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT乙片段GGCATCTTAAAATTCCGTAG重组DNA分子RecombinantDNAGGCATCTTAAAATTCCGTAG

③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别（二）“分子缝合针”——DNA连接酶

DNA连接酶(1)常用的DNA连接酶

.DNA聚合酶与DNA连接酶是同一种酶的不同名称吗?相同区别DNA聚合酶形成磷酸二酯键只能将单个核苷酸连接到核酸片段上;以一条DNA链为模板,形成互补的DNA链。DNA连接酶将两个DNA片段之是形成磷酸二脂键；将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板。问题:DNA复制时需要哪些酶?

三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体载体需要的条件：有1~多个限制酶切点对受体细胞无害导入基因能在受体细胞中复制、表达有某些标记基因，便于筛选常用运载