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四川大学硕士学位论文辩论答辩人:许可专业:生物化学与分子生物学业方向:基因的分子生物学指导教师:张义正教授甘薯〔Ipomoeabatatas(L).Lam〕Rubisco活化酶基因的克隆和表达

研究背景研究意义研究内容技术路线材料和方法结果讨论致谢

研究背景甘薯具有广泛的种植面积甘薯含丰富的淀粉，能够用于工业乙醇的生产生产条件限制使利用甘薯生产工业乙醇本钱较高提高光合效率以提高甘薯产量Rubisco活化酶是植物光合作用的关键酶

Rubisco活化酶作用机制

研究意义在甘薯中Rubisco活化酶末被克隆在甘薯中Rubisco活化酶组成情况不明确在甘薯中Rubisco活化酶表达情况不清楚对Rubsico活化酶进行深入的分了生物学研究为以后利用分了生物学进行改造奠定了根底

研究内容甘薯Rubisco活化酶基因克隆、表达及纯化多克隆抗体制备及效价检测Western检测Rubsico活化酶在甘薯中的组成情况甘薯Rubsico活化酶基因表达的组织和时间特异性分析不同品种甘薯光合作用与生产力的关系分析

技术路线正常生长甘薯植株采集叶片提取总RNA提取Rubisco活化酶RT-PCR分析利用RACE技术克隆基因全长克隆基因ORF构建原核表达载体表达、纯化制备多克隆抗体抗体检测Western检测选择甘薯品种小区试验种植利用便携式光合仪测定净光合速率测定各品种生物产量进行比较根据报道的物种的保守序列克隆IBrcaI片段

材料植物材料:甘薯潮薯1号:购于四川省农科院，自然栽培，取其各组织材料。甘薯潮薯1号、绵粉1号、徐薯18用于测定不同品种甘薯光合作用与生产力的关系。动物材料新西兰大白兔购自四川大学华西啮齿动物实验中心，适应性饲养1周后进行免疫反响。材料和方法

名称引物序列作用3-CDS5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30-3基因全长扩增UPM15-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’UPM25-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3IBAP5-ACGGAGGGNGGGGNGGGGGG-3IBrca-15-ATCCATGGCTGCCTCCGTCTC-3IBrca-25-GTGGCGTTCACCATCTGGTTG-3IBrcaI-3:5-TGGGTTTTACATTGCCCCTGCCTTC-3IBrcaI-55-TTTCCTTGACCTTTGCCTCCCCAGA-3IBrcaI-L5-TCAACTTTGAATTGAACTTCAGCA-3ORF扩增IBrcaI-R5-AATTTGTTTCATCCAAATTTTATTTG-3IBtub-15-CAACTACCAGCCACCAACTGT-3Tublin扩增IBtub-25-TCCATAAGAGGGCATAACTAGTG-3IBrca-E15’-CATGCCATGGCTACCTCCAGTGTCC-3’含NcoI位点扩增IBrca编码序列IBrca-E25’-GGAATTCAGTGAGGCCTCGTGCTTAGC-3’含EcoRI位点引物

pMD18-T载体物理图谱

pET-32a(+)的物理图谱

常规的分子生物学技术(RNA提取、反转录、PCR、酶切……)大肠杆菌表达及产物纯化多克隆抗体制备及效价检测Westernblot及RT-PCR检测

结果IBrcaI基因全长及ORF序列的克隆与分析IBrcaI基因的表达与纯化多克隆抗体的制备和效价检测甘薯IBrcaI基因表达产物的western检测甘薯IBrcaI基因表达的组织与时间特异性分析不同甘薯品种光合作用与生产力的关系分析

结果图1甘薯叶片总RNA琼脂糖电泳

A1MBM12图2甘薯IBrcaIcDNA片段克隆A：M为分子量标准〔λH/E〕；第1道为的PCR产物；BM为分子量标准；第1道为重组质粒，第2道为重组T载体双酶切〔EcoRⅠ和HindⅢ〕产物

AM1B1M图33-RACE产物及酶切分析A：M为分子量标准〔λH/E〕；第1道为的3-RACEPCR产物；B：M为分子量标准；第1道为重组T载体双酶切〔EcoRⅠ和HindⅢ〕产物

M12图45-RACE产物及酶切分析M为